Файл: Наследственность с точки зрения молекулярной биологии. Строение нуклеиновых кислот. Роль нуклеиновых кислот. Понятие гена. Репликация, транскрипция, трансляция. Понятие промотора и оперона. Особенности экспрессии генов у прокариот и эукариот.docx
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 23.11.2023
Просмотров: 94
Скачиваний: 2
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
-
Наследственность с точки зрения молекулярной биологии. Строение нуклеиновых кислот. Роль нуклеиновых кислот. Понятие гена. Репликация, транскрипция, трансляция. Понятие промотора и оперона. Особенности экспрессии генов у прокариот и эукариот.
Репликация – синтез дочерней молекулы ДНК на матрице родительской молекулы ДНК, который происходит в процессе деления клетки.
Транскрипция – синтез молекулы РНК на матрице ДНК. Другими словами, это перенос генетической информации с ДНК на РНК.
Трансляция – синтез белка на матрице иРНК при участии рибосом.
Промотор – сайт ДНК(строгая нуклеотидная последовательность), к которому присоединяется РНК-полимераза.
2.Селекция клеток. Методы и подходы в селекции.
Клеточная селекция - отбор в культуре in vitro мутантных клеточных линий, устойчивых к определенным селективным агентам или факторам среды, и получение от них растений-регенерантов, обладающих соответствующими признаками.
В настоящее время сформировалось четыре основных подхода, используемых в селекционной работе:
1. отбор штаммов, обладающих ценными признаками, проявляющимися в конкретных условиях их существования и благоприятствующими выживанию (синтез антибиотика, способность к более быстрому усвоению того или иного питательного вещества); при размножении такой культуры (с учетом частоты спонтанных мутаций) наступает популяционное давление, когда наиболее приспособленная мутантная форма вытесняет исходную в популяции (естественный отбор);
2. искусственный отбор клонов микроорганизмов с полезными для человека признаками, возникшими на основе естественной изменчивости родительских форм. К такому отбору прибегают тогда, когда контролируемый признак биологически малоценен для микроорганизма и поэтому трудно создать условия выращивания культуры, в которых относительно легко удавалось бы выделять штаммы с нужными признаками в естественных условиях. При этом необходимо проверять большое число клонов
и субклонов, и если вариации между ними по контролируемому признаку невелики, то успех выборки оказывается мало вероятным или небольшим.
Эти методы селекции основываются на использовании спонтанных скачкообразных наследственных изменений генов - мутаций, вызванных процессами рекомбинации генетического материала in vivo (амплификация, конъюгация, трансдукция, трансформация и пр.). Процессы слепого многоступенчатого отбора случайных мутаций чрезвычайно длительны и могут занимать целые годы.
Более эффективен метод искусственного изменения генома, что резко, на много порядков увеличивает частоту мутаций - индуцированный мутагенез, основанный на использовании мутагенного действия ряда химических соединений (гидроксиламин, нитрозамины, азотистая кислота, бромурацил, 2-аминопурин, алкилирующие агенты, антибиотики и др.), нейтронных, γ-, рентгеновских и ультрафиолетовых лучей, ультразвука, темпера-туры, биологических мутагенов (фаги, вирусы, биотоксины). Мутагены вызывают замены и делеции (удаления) оснований в составе ДНК, а также индуцируют мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания информации. По механизму действия все мутагены можно разделить на две группы:
1. Мутагены прямого действия, непосредственно воздействующие на ДНК;
2. Мутагены непрямого действия. Такие мутагены непосредственно на ДНК не действуют, однако они вызывают образование других веществ, которые и вызывают мутации. Например различные виды ионизирующего излучения вызывают образование в клетках пероксидных радикалов, которые в свою очередь повреждают ДНК.
3. Эффективной технологией, позволяющей совместить возможности различных видов мутагенеза и искусственого отбора форм является ступенчатая селекция - исходную культуру клеток, у которых интересующий человека признак развит в очень незначительной степени, обрабатывают мутагенами различной природы, что обычно вызывает резкое увеличение частоты различных мутаций. Далее среди образовавшихся мутантных форм проводят поиск (скрининг) таких, у которых интересующий полезный признак усилился. Эти клетки отбирают и получают на их основе чистую культуру, которую опять подвергают воздействию мутагенных факторов различной природы. Далее опять проводят отбор наиболее эффективных мутантов. Процедуры мутагенеза и скрининга повторяют необходимое количество раз, добиваясь существенного возрастания контролируемого показателя (активность, продуктивность и др.).
Несмотря на трудоемкость методов селекции, они до настоящего времени не потеряли своего значения для создания высокоэффективных микроорганизмов – продуцентов. Для примера можно указать успехи с селекцией мутантов пенициллина, исходный штамм которого, выделенный из воздуха А. Флемингом в 1928 г., продуцировал лишь 50 единиц антибиотика пенициллина в 1 мл культуральной жидкости. Во время второй мировой войны 1939-1945 гг. ученые вернулись к этому виду гриба и занялись генетико-селекционной работой с ним. В 1951 г. путем рассева естественной популяции клеток, выросших в глубинных условиях культивирования Penicilliumchrysogenum, был выделен штамм № 1951 с активностью 100ЕД/мл.
4. Искусственное, целенаправленное конструирование геномов с использованием методов клеточной (соматическая, парасексуальная гибридизация, гибридомная генология) и генной инженерии (направленный мутагенез).
3. Мутагенез. Основные мутагены применяемые в селекции. Механизм действия мутагенов.
В настоящее время сформировалось четыре основных подхода, используемых в селекционной работе:
1. отбор штаммов, обладающих ценными признаками, проявляющимися в конкретных условиях их существования и благоприятствующими выживанию (синтез антибиотика, способность к более быстрому усвоению того или иного питательного вещества); при размножении такой культуры (с учетом частоты спонтанных мутаций) наступает популяционное давление, когда наиболее приспособленная мутантная форма вытесняет исходную в популяции. Этот подход опирается на естественный ход событий у микроорганизмов в измененных условиях (естественный отбор);
2. искусственный отбор клонов микроорганизмов с полезными для человека признаками, возникшими на основе естественной изменчивости родительских форм. К такому отбору прибегают тогда, когда контролируемый признак биологически малоценен для микроорганизма и поэтому трудно создать условия выращивания культуры, в которых относительно легко удавалось бы выделять штаммы с нужными признаками в естественных условиях. При этом необходимо проверять большое число клонов и субклонов, и если вариации между ними по контролируемому признаку невелики, то успех выборки оказывается мало вероятным или небольшим.
Эти методы селекции основываются на использовании спонтанных скачкообразных наследственных изменений генов -
мутаций, вызванных процессами рекомбинации генетического материала in vivo (амплификация, конъюгация, трансдукция, трансформация и пр.). Процессы слепого многоступенчатого отбора случайных мутаций чрезвычайно длительны и могут занимать целые годы. Это обусловлено тем, что для возникновения мутаций интересующий ген должен реплицироваться 106 - 108 раз, однако это вовсе не означает, что любой получившийся мутант будет обладать полезными свойствами. Большинство мутаций неблагоприятны для организма, часто летальны, и лишь ничтожная часть их может способствовать выживанию или повышению выхода целевого продукта. Поэтому методы селекции основанные на отборе естественно возникающих мутантов являются очень длительными, непредсказуемыми и применимы только к организмам с коротким временем жизни и высокой частотой смены поколений (микроорганизмы).
Более эффективен метод искусственного изменения генома, что резко, на много порядков увеличивает частоту мутаций. Таким методом является индуцированный мутагенез, основанный на использовании мутагенного действия ряда химических соединений (гидроксиламин, нитрозамины, азотистая кислота, бромурацил, 2-аминопурин, алкилирующие агенты, антибиотики и др.), нейтронных, γ-, рентгеновских и ультрафиолетовых лучей, ультразвука, темпера-туры, биологических мутагенов (фаги, вирусы, биотоксины). Мутагены вызывают замены и делеции (удаления) оснований в составе ДНК, а также индуцируют мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания информации. По механизму действия все мутагены можно разделить на две группы:
1. Мутагены прямого действия, непосредственно воздействующие на ДНК;
2. Мутагены непрямого действия. Такие мутагены непосредственно на ДНК не действуют, однако они вызывают образование других веществ, которые и вызывают мутации. Например различные виды ионизирующего излучения вызывают образование в клетках пероксидных радикалов, которые в свою очередь повреждают ДНК. Мутагены непрямого действия могут так же повреждать различные специфические белки-ферменты участвующие в процессах репликации и транскрипции гена.
3. Эффективной технологией, позволяющей совместить возможности различных видов мутагенеза и искусственого отбора форм является ступенчатая селекция. Сущность метода состоит в том, что исходную культуру клеток, у которых интересующий человека признак развит в очень незначительной степени, обрабатывают мутагенами различной природы, что обычно вызывает резкое увеличение частоты различных мутаций. Далее среди образовавшихся мутантных форм проводят поиск (скрининг) таких, у которых интересующий полезный признак усилился. Эти клетки отбирают и получают на их основе чистую культуру, которую опять подвергают воздействию мутагенных факторов различной природы. Далее опять проводят отбор наиболее эффективных мутантов. Процедуры мутагенеза и скрининга повторяют необходимое количество раз, добиваясь существенного возрастания контролируемого показателя (активность, продуктивность и др.).
Несмотря на трудоемкость методов селекции, они до настоящего времени не потеряли своего значения для создания высокоэффективных микроорганизмов – продуцентов. Для примера можно указать успехи с селекцией мутантов пеницилинла, исходный штамм которого, выделенный из воздуха А. Флемингом в 1928 г., продуцировал лишь 50 единиц антибиотика пенициллина в 1 мл культуральной жидкости. Во время второй мировой войны 1939-1945 гг. ученые вернулись к этому виду гриба и занялись генетико-селекционной работой с ним. В 1951 г. путем рассева естественной популяции клеток, выросших в глубинных условиях культивирования Penicilliumchrysogenum, был выделен штамм № 1951 с активностью 100ЕД/мл. Его колония и стала родоначальницей всех производственных штаммов в различных странах мира. Используя селекцию и комбинированное воздействие различными мутагенами (преимущественно – УФ-лучи и алкилирующие агенты), уже в начале 60-х годов удалось передать в производство штамм, образующий пенициллин в количестве 5000 ЕД и более в 1мл культуральной жидкости. В настоящее время используются штаммы, продуцирующие десятки тысяч единиц антибиотика в 1 мл среды. В 1983 г. С.Браун и С.Оливер использовали методы селекции для отбора мутантных штаммов дрожжей, устойчивых к высоким концентрациям конечного продукта (10 %-го этанола), при культивировании их в непрерывном режиме (650 ч). Методами мутагенеза и селекции получены штаммы Eremotheciumashbyii,способные выделять до 1,8 мг рибофлавина в 1 мл среды, и штаммы Brevibacteriumammoniegenes, продуцирующие до 1 г HSKoA на 1 л среды.
4. Искусственное, целенаправленное конструирование геномов с использованием методов клеточной (соматическа, парасексуальная гибридизация, гибридомная гехнология) и генной инженерии (направленный мутагенез).
4. Рекомбинантные ДНК. Методы получения рекомбинантных ДНК.
Основы генетической инженерии.
В первой половине 70-х годов ХХ в. развитие молекулярной биологии привело к возникновению новой экспериментальной технологии, которая получила в СССР название “генная инженерия”, а в западной литературе именуется “работой с рекомбинантными молекулами ДНК”.
Молекула рекомбинантной ДНКпредставляет собой два компонента, соединенные в бесклеточной системе: вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент