Повышение эффективности секреции

Стабильность белков, кодируемых клонирован­ными генами, значительно зависит от их клеточной локали­зации. Например, рекомбинантный проинсулин оказывается примерно в 10 раз более стабиль­ным, если он секретируется (экспортируется) в периплазму (пространство между плазматиче­ской и наружной мембранами у грамотрицательных бактерий), а не остается в цитоплазме. Кроме того, белки, секретируемые в периплазму или в среду, легче очистить. Обычно транспорт белков через клеточную мембрану обеспечивают специфические N-концевые аминокис­лотные последовательности, называемые сиг­нальными пептидами (сигнальными последова­тельностями, лидерными пептидами). Иногда удается сделать белок секретируемым, присое­динив к кодирующему его гену нуклеотидную последовательность, ответственную за синтез сигнального пептида. Однако простое наличие сигнального пептида не обеспечивает эффек­тивной секреции. Кроме того, Е. coli и другие грамотрицательные микроорганизмы обычно не могут секретировать белки в окружающую среду из-за наличия наружной мембраны. Есть, по крайней мере, два способа решения этой пробле­мы. Первый - использование грамположительных бактерий, у которых нет наружной мембраны, второй - создание с помощью генной инженерии грамотрицательных бактерий, способных секретировать белки в культуральную среду.
9. Метаболитическая перегрузка

Как мы уже отмечали введение в клетку чужеродной ДНК, и ее экспрессия часто приводят к различным нарушениям клеточного метаболизма. Это явление носит название метаболитическая перегрузка и может возникать по разным причинам:

1.Увеличение затрат энергии (АТФ) и метаболитов на экспрессию, как клонированного гена так и генов самого вектора, и возможность их истощения.

2. Нехватка кислорода и невозможность обеспечения им всех метаболити-ческих реакций, как нужных для клетки, так и для экспрессии клонируемого гена.

3. Нарушение внутриклеточной локализации и экспорта жизненно важных клеточных белков, вследствие перепроизводства чужеродного белка

Это может привести к таким нежелательным явлениям как снижение скорости роста трансформированных клеток, потере ими рекомбинантных плазмид или удалению рекомбинантного гена из плазмиды. Поскольку клеткам, растущим в условиях мета¬болической перегрузки, не хватает энергии для нормального функционирования, нарушения затрагивают прежде всего такие энергоемкие метаболические процессы, как фиксация азота или синтез белков. Могут изменяться также размер и форма клеток, образовываться слишком много внеклеточного полисахарида, склеивающего клетки друг с дру¬гом и затрудняющего микрофильтрацию. Как следствие метаболической перегрузки, обусловленной образованием избыточного ко¬личества чужеродного белка и нехваткой пита¬тельных веществ или «строительных блоков» - аминокислот, может произойти запуск стрессо¬вых механизмов, в частности инициироваться синтез клеточных протеаз, под действием ко¬торых произойдет быстрая деградация рекомбинантного белка. Многократно возрастает вероятность трансляционных ошибок. Так для Е. Coli в нормальных условиях она составляет 2•10-4 - 2•10-3 % на 1 клетку за генерацию. Однако в условиях нехватки опреде¬ленных аминоацил-тРНК или гуанизинтрифосфата, что часто случается при суперпродукции чужеродных белков, веро¬ятность включения в белковую молекулу непра¬вильной амино-кислоты, вместо недостающей сильно увеличивается (в десятки и сотни раз).

---

Это не позволяет использовать синтезируемый белок в качестве лекарствен-ного средства, поскольку:

1) удельная активность и стабильность белка могут быть гораздо ниже ожидаемых;

2) наличие в молекуле «неправиль¬ных» аминокислот может вызвать нежелатель¬ную иммунологическую реакцию при введении такого белка в организм человека.

Для снижения влияния метаболитической перегрузки используют следующие подходы или их комбинацию:

1.Использование малокопийных плазмидных векторов.

2.Отказ от использования векторов и встраивание клонируемого вектора в хромосомную ДНК организма-хозяина.

3. Использование регулируемых промоторов.

4. На практике эффективным спосо¬бом увеличения количества чужеродного белка, синтезируемого рекомбинантным микроорганиз¬мом, состоит в поддержании уровня экспрессии его гена на среднем уровне (так, чтобы на долю продукта приходилось примерно 5% суммарного клеточного белка), но при максимальной плотности клеточной культуры, что достигается подбором соответствующих условий (аэрирование, перемешивание, термостатирование). Так микробиологиче¬ская система с 5%-ным уровнем экспрессии чу¬жеродного белка и низкой метаболической нагрузкой, в которой плотность может достигать 40 г/л (масса сухого вещества), оказывается более эффективной, чем система с 15%-ым уровнем экспрессии и плотностью 10 г/л.

10. Направленный мутагенез

Технология рекомбинантных ДНК позволяет выделять гены любых белков, существующих в природе, экспрессировать их в специфическом хозяйском организме и получать чистые белко¬вые продукты. Однако физические и химиче-ские свойства таких «природных» белков часто не удовлетворяют условиям, обеспечивающим возможность их промышленного применения. Иногда для получения белков, обладающих нужными свойствами, в качестве источника со-ответствующих генов используют организмы, растущие в необычных, зачастую экстремаль¬ных условиях. Например, для синтеза ά-амилазы, не утрачивающей своей активности при вы¬сокой температуре, выделили ее ген из Bacillus stearothermophilus- бактерии, естественной сре¬дой обитания которой являются горячие источ¬ники с температурой воды 90 °С. Полученная та¬ким образом α-амилаза оставалась активной при более высоких температурах, чем те при которых обычно осуществляют промышленное производство этилового спирта из крахмала. Это значительно облегчает поддержание асептических условий и ускоряет процесс. Для получения белков с заранее за¬данными свойствами можно использовать также мутантные формы генов. Однако число мутантных белков, образующихся в результате замены отдельных нуклеотидов в структурном гене с по¬мощью обычного, классического мутагенеза, чрезвычайно ве¬лико. Однако даже мутагенез с последующим отбором редко приводит к

---

существенному улучшению свойств исходного белка, поскольку большинство ами¬нокислотных замен (мутаций) сопровождается снижением активности фермента. Для создания белков со специфическими свой¬ствами можно использовать другой подход, осно¬ванный на целенаправленном внесении изменений в кодирующие их клонированные гены (направленный мутагенез). Это позволяет получать белки с другими, чем у их аналогов, свойствами. 1. С более высокой каталитической активностью 2. Более высокой специфичностью 3. С более высокой стабильностью (температура, диапазон рН) 4. Способные функционировать в безводных растворителях 5. Обладающие и сохраняющие каталитическую активность без участия кофакторов 6. Обладающие повышенной устойчивостью к клеточным протеазам Направленный мутагенез: методика Получить принципиально новый белок с заранее заданными необычными свойствами - задача, в настоящее время еще не разрешимая. Однако сейчас вполне реаль¬но целенаправленно и существенно изменить свойства уже существующих белков. Изменения можно вносить в сам белок, однако химическая модификация белков редко бывает специфичной и ее необходимо осуществлять заново для каждой белковой молекулы. Поэтому лучше вносить изменения в ген, кодирующий синтез этого белка. Введение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящих к определенным изменениям в аминокислотных последовательностях, называется направленным мутагенезом. Процедура осуществляется с использованием стандартных методов генной инженерии и не составляет особого труда. Основная сложность заключается в том, что не всегда известно, какую аминокислоту или последовательность аминокислот нужно изменить, чтобы получить белок с нужными свойствами. Изменения могут затрагивать аминокислотные остатки, расположенные в разных участках полипептидной цепи, которые потом сближаются при укладке белковой молекулы. Выбор аминокислоты, подлежащей замене, как правило, производится эмпирически, с учетом ее роли в функционировании белка. Данные об этом получают в ходе биохимических исследований или в методом рентгеноструктурного анализа трехмерной структуры белка или лучше комплекса белок - лиганд(субстрат). Поэтому положительный результат пока достигается достаточно редко. В последнее время значительное развитие получил перспективный подход к получению высокоактивных белков, основанный на использовании методов компьютерного молекулярного дизайна. В качестве примера можно привести работу сотрудников МГУ по созданию эффективных биокатализаторов-ферментов, значительно превосходящих природные аналоги. В качестве модели был взят фермент пенициллинацилаза из Е. Coli, который широко применяется в фармацевтических производствах для получения полусинтетических пенициллинов. Его химическая и пространственная трехмерная структура установлена уже довольно давно. С помощью специально разработанной компьютерной программы было смоделировано улучшение свойств этого фермента. Для повышения активности и специфичности фермента виртуально варьировались (заменялись) аминокислотные остатки его активного центра, которые участвуют в связывании субстрата. Для каждой мутации проверялось (виртуально, методом молекулярного докинга) сродство новой формы фермента к субстрату. Мерой сродства служила величина энергии связывания субстрата с виртуальной молекулой фермента Всего было проскринировано более 3000 мутантных форм фермента, несущих произвольные одиночные и двойные мутации, среди которых были обнаружены мутантные формы, связывающие субстрат почти в 100 раз лучше природного фермента. Далее зная структуру такого высокоэффективного мутанта можно искусственно сконструировать фрагмент ДНК, кодирующий его аминокислотную последовательность и в дальнейшем клонировать его в подходящем организме – хозяине. В настоящее время подобные исследования являются достаточно дорогими и трудоемкими и в основном еще не вышли за рамки научных лабораторий. Есть надежда, что уже в ближайшем будущем развитие протеомики, аналитической и компьютерной техники позволит точно и быстро предсказывать свойства того или иного белка, исходя из данных о его аминокислотной последовательности. Это значительно упростит процедуру искусственного создания нужных белков с заданными свойствами.

---

11. Получение рекомбинантных белков (инсулин, соматостатин,

соматотропин, интерферон). Использование трансгенных живот-

ных для их получения.

Рекомбинантные белки - результат новых комбинаций генов, которые формируют ДНК. Рекомбинантные технологии ДНК позволяют получать белки дикого типа и модифицированные белки человека и млекопитающих в больших количествах. Рекомбинантные белки получены на основе клонированных последовательностей ДНК, которые обычно кодируют ферменты и белки с известными функциями.

Получение инсулина (доступно для понимания) добывают из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Она поставляется в вагонах- рефрижераторах на фармацевтические предприятия, где проводят экстракцию

гормона. Для получения 100 г крис­таллического инсулина необходимо 800 -1000

кг исходного сырья. Однако такой инсулин отличается по строению

(аминокислотной последовательности) от инсулина человека и его использование

напрямую малоэффективно. Например свиной инсулин отличается от

человеческого на одну аминокислоту у С-конца В-цепи (аланин вместо треонина-

на) Поэтому предварительно проводят химическую модификацию животного

инсулина с целью придания ему структуры человеческого инсулина. Замену

аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом

отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по

карбоксильной группе остатка треонина, присутствуещего в реакционной смеси в

большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы

получают инсулин человека.

В дальнейшем был разработан метод получения проинсулина

человека целиком, с последующей его трансформацией в инсулин in vitro. Для

этого искусственно была синтезирована нуклеотидная последовательность

кодирующая структуру проинсулина, которая затем была встроена в плазмиду к 3

'-концу гена β-галактозидазы. Трансформированные такими плазмидами клетки

Е. coli синтезировали химерный белок, состоящий из фрагментов проинсулина и

β-галактозидазы, который далее in vitro последовательно превращали в инсулин

человека
Получение соматостатина – гормона гипоталамуса (это жесть, лучше не читать)

---

Участок ДНК, кодирующий гормон соматостатин, получен путем

последовательного соединения тринуклеотидов, отвечающих определенной

аминокислоте. Из 52 н. п. синтетического гена 42 пары составляли структурный

ген гормона, а остальные слу­жили для присоединения синтетического гена к

плазмиде pBR322, а также к сегменту лактозного оперона (lac) из генома Е. coli

или к β-галактозидазному гену. Такую синтетическую чужеродную ДНК

встраивали непосредственно за бактериальным геномом (или внут­ри его) после

расщепления ДНК рестрикционными эндонуклеазами с образованием в

результате трансляции гибридного белка.

Синтетический ген соматостатина был встроен в плазмиду pBR322 E. coli

вблизи конца гена, кодирующего фер­мент β-галактозидазу. Между двумя генами

был помещен кодон метионина. После выделения рекомбинантной плазмиды в

бакте­риальную клетку кишечная палочка стала синтезировать гибридный белок.

---

Смотрите также файлы

• Жасы 3 Жынысы ыз Туан кні, айы, жылы.docx

• Ссиональная направленность преподавания истории как инструмент для формирования у обучающихся мотивации к будущей профессиональной деятельности.docx

• Отчет по производственной практике по профессиональному модулю пм. 07 Соадминистрирование баз данных и серверов.docx

• Согласие на обработку персональных данных я.docx

• Описание содержания.docx