Файл: Наследственность с точки зрения молекулярной биологии. Строение нуклеиновых кислот. Роль нуклеиновых кислот. Понятие гена. Репликация, транскрипция, трансляция. Понятие промотора и оперона. Особенности экспрессии генов у прокариот и эукариот.docx
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 23.11.2023
Просмотров: 97
Скачиваний: 2
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Часть его (соматостатин) затем отщепляли от β-галактозидазы BrCN. Такой
сложный способ получения гормона был необходим, так как соматостатин,
синтезированный в виде свободных молекул, быстро деградирует под действием
бактериальных протеаз.
Получение соматотропина – гормона роста из передней доли гипофиза (вторая часть понятна)
Сначала клонировали двунитевую кДНК; далее путем
расщепления получали последовательность, кодирующую аминокислотный
порядок гормона, за исключением первых 23 аминокислот, - с фен (—NH2) до лей
(23), и синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от
первой до двадцать третьей со стартовым ATG-кодоном в начале. Затем два
фрагмента объединяли и подстраивали к паре lac-промоторов и участку
связывания рибосом.
ГРЧ в клетках Е. coli и в культуре клеток животных был получен в 1982 г Оказалось, что в бактериальных клетках возможен синтез аналогов ГРЧ.
Огромный интерес представляют выделение и синтез полипептида,
обладающего полной биологической активностью гипоталамического рилизинг-
фактора соматотропина (СТГ-РФ). Введение этого фактора способно
компенсировать недостаток соматотропина. Таким образом, наличие СТГ-РФ и
самого гормона, полученных в генетически сконструированных бактериальных
клетках, очень важно для успешного лечения заболеваний, обусловленных
недостатком этого гормона, и ряда патологических заболеваний, таких, как
некоторые формы диабета, регенерация тканей после ожогов и др.
Предполагается, что СТГ-РФ можно использовать и для увеличения массы и
роста домашних животных, так как он, не обладая видовой специфичностью,
способен стимулировать освобождение гормона роста у ряда животных.
Интерфероны (ИФН) – (понятно 50/50) - это группа белков и гликопротеинов, каждый из
которых синтезируется определенными клетками организма и выполняет
специфические функции. Известно около 20 природных ИФН, различающихся по
структуре и биологическим свойствам: α-ИФН состоит из 12 подвидов, β-ИФН -
из 3-4 подвидов, γ-ИФН - из 2-3 подвидов. Рекомбинантные ИФН также имеют
разновидности.
Продуцентом α-ИФН являются лейкоциты периферической крови
человека, которые культивируют на специальной среде в присутствии вируса -
интерфероногена. Нативный ИФН выделяют из культуральной жидкости
осаждением и хроматографией. Метод имеет ограниченное применение из-за
необходимости использования большего количества донорской крови.
β-ИФН синтезируется в культуре фибробластов (клеток соединительной
ткани человека) в присутствии в качестве интерфероногена двухцепочечной РНК.
γ-ИФИ - в культуре иммунных Т- или В-лимфоцитов, в том и другом
случае с низким выходом, поэтому производство с использованием культур
клеток человека - процесс дорогостоящий. Экономически оправдано получение
ИФН с использованием рекомбинантных культур микроорганизмов: Bacillus
subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Saccharomyces cerevisiae. Очистку ИФН
проводят методом аффинной хроматографии с использованием моноклональных
антител.
Технологическая схема получения генно-инженерных интерферонов (как
одна из возможных) принципиально сводится к следующему:
1. индукция синтеза и выделение интерфероновой мРНК из клеток,
2. получение кДНК, комплементарной интерфероновой мРНК из
лейкоцитов,
3. встраивание кДНК в плазмиду,
4. введение реконструированной плазмиды в клетки Е. coli,
5. размножение бактерий, содержащих реконструированную плазмиду, в
культуральной среде,
6. сепарирование клеток Е. coli,
7. дезинтеграция и экстракция клеток Е. coli,
8. осаждение (например, полиэтиленамином) с последующим центрифуги-
ованием,
9. высаливание интерферона из супернатанта сульфатом аммония
10. диализ осадка интерферона,
11. растворение интерферона, пропускание раствора через колонку с имму-
носорбентом (пришитыми моноклональными антителами),
12. элюция интерферона с последующей хроматографией на целлюлозном
катионообменнике.
Использование трансгенных животных и растений для
получения лекарственных препаратов белковой природы
(Информация очень понятна и интересна)
Применение методов генетической инженерии в животноводстве и
растениеводстве открывает перспективу изменения ряда свойств организма:
повышение продуктивности, резистентности к заболеваниям, увеличение
скорости роста, улучшение качества продукции и др. Животных и растения,
которые несут в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, принято
называть трансгенными, а ген, интегрированный в геном реципиента, -
трансгеном. Продукт этого гена (белок) является трансгенным. Благодаря
переносу генов у трансгенных организмов возникают новые качества, а
дальнейшая селекция позволяет закрепить их в потомстве и создавать
трансгенные линии.
Введение чужеродной ДНК животным можно осуществить разными
методами:
1) с помощью ретровирусных векторов, инфицирующих клетки эмбриона на
ранних стадиях развития перед имплантацией эмбриона в самку-реципиента;
2) микроинъекцией в увеличенное ядро спермия (мужской пронуклеус)
оплодотворенной яйцеклетки;
3) введением генетически модифицированных эмбриональных стволовых
клеток в предимплантированный эмбрион на ранних стадиях развития.
У родившихся потомков исследуют экспрессию трансгена на уровне
транскрипции и трансляции. Трансгенное потомство получают путем
использования традиционных методов разведения животных.
Эксперименты по генетической модификации многоклеточных организмов
путем введения в них трансгенов требуют много времени. Тем не менее
трансгеноз стал мощным инструментом для исследования молекулярных основ
экспрессии генов млекопитающих и их развития, для создания модельных систем,
позволяющих изучать болезни человека, а также для генетической модификации
клеток молочных желез животных с целью получения с молоком важных для
медицины белков. Был даже предложен новый термин «фарминг», относящийся к
процессу получения из молока трансгенных домашних ("pharm") животных
аутентичных белков человека или фармацевтических препаратов. Использование
молока целесообразно потому, что оно образуется в организме животного в
большом количестве и его можно надаивать по мере надобности без вреда для
животного. Вырабатываемый молочной железой и секретируемый в молоко
новый белок не должен при этом оказывать никаких побочных эффектов на
нормальные физиологические процессы, протекающие в организме трансгенного
животного, и подвергаться посттрансляционным изменениям, которые по крайней
мере близки к таковым в клетках человека. Кроме того, его выделение из молока,
которое содержит и другие белки, не должно составлять большого труда.
Молочная железа - великолепный продуцент чужеродных белков, которые
можно получать из молока и использовать в фармацевтической и пищевой
промышленности. Из молока трансгенных животных извлекают следующие
рекомбинантные белки: человеческий белок С (антитромбин), антигемофильный
фактор IX, α-1-антитрипсин, тканевой плазменный активатор, лактоферин,
сывороточный альбумин, интерлейкин-2, урокиназу и химозин.
Следует заметить, что создание клеточных культур и их выращивание в
промышленных реакторах, а также выведение трансгенных животных и их
обслуживание - дорогие и сложные процедуры. Однако трансгенные животные
легко размножаются, содержание их сравнительно дешево, что делает этих
животных хорошими продуцентами разнообразных белков с низкой стоимостью.
ПРИМЕР В России группой ученых под руководством Л. К. Эрнста получены трансгенные
овцы с геном химозина, в 1 л молока которых содержится 200 - 300 мг химозина -
основного компонента для производства сыра. Стоимость его будет в несколько
раз ниже продукта, получаемого традиционным способом из сычугов молочных
телят и ягнят. Приведены данные, свидетельствующие о высокой эффективности
производства сыра с использованием химозина молока трансгенных овец. Так, из
3 л молока трансгенной овцы можно получить достаточное количество химозина
для производства 1 т сыра из коровьего молока.
12. Использование рекомбинантных микроорганизмов
для получения коммерческих продуктов небелковой
природы.
Помимо получения белковых продуктов достижения генной инженерии
можно использовать для крупномасштабного производства различных ценных
низкомолекулярных небелковых соединений – витаминов, аминокислот,
антибиотиков и др.
Используя технологию рекомбинантных ДНК, можно направленно изменять
метаболизм микроорганизмов, вводя в них новые гены или модифицируя уже
существующие. Основной целью таких изменений является создание
рекомбинан-тного микроорганизма с новой ферментативной активностью,
способного превращать существующий субстрат в ценный продукт, который
обычно получают только сочетанием химических и микробиологических методов.
Синтез L-аскорбиновой кислоты (мне было понятно все, кроме схем)
В производстве аскорбиновой кислоты используется процесс, состоящий из 1 микро биологической реакции и 4 химических, это весьма трудоемкий процесс. Вот схема.
Было бы круто усовершенствовать этот процесс, заменив
большинство химических стадий на одну микробиологическую. К сожалению, такое культивирование имеет
свои трудности, поскольку эти микроорганизмы могут иметь разные оптимумы
температуры и рН, могут различаться также состав среды и скорость роста.
Иными словами, условия культивирования, оптимальные для одного организма,
могут быть неприемлемы для другого, что приведет к спонтанному «вымыванию»
из среды одного из них.
Поэтому наилучшим выходом из этой
ситуации было бы создание одного микроорганизма, синтезирующего все
ферменты, необходимые для превращения глюкозы в 2-KLG. Вот схема.
Erwinia herbicola осуществляет превращение D-глюкозы в 2,5-DKG в несколько стадий,
катализируемых разными ферментами, в то время как Cotynebacterium sp. для
превращения 2,5-DKG в 2-KLG необходима только одна стадия. Следовательно,
наиболее простой способ создания одного микроорганизма, способного
превращать D-глюкозу в 2-KLG, состоит в выделении гена 2,5-ОКС-редуктазы
Corynebacterium sp. и введении его в Erwinia herbicola
Таким образом, с помощью генетических манипуляций метаболические
реакции, протекающие в столь разных микроорганизмах, удалось осуществить в
одном из них. Этот гибрид приобрел способность синтезировать конечный
продукт комбинированного метаболического пути. Такой организм можно
использовать как фабрику для производства 2-KLG, заменяющую первые три
стадии в том процессе получения L-аскорбиновой кислоты, который используют
в настоящее время.
13. Использование генной инженерии для совершенствования производства антибиотиков.
С помощью генной инженерии можно не только создавать новые антибиотики, но и увеличивать эффективность синтеза уже известных. Лимитирующим фактором в промышленном производстве антибиотиков с помощью Streptomyces spp. часто является количество доступного клеткам кислорода. Вследствие плохой растворимости кислорода в воде и высокой плотности культуры Streptomyces его часто оказывается недостаточно, рост клеток замедляется и выход антибиотика снижается. Чтобы решить эту проблему, можно, во-первых, изменить конструкцию биореакторов, в которых выращивается культура Streptomyces, а во-вторых,
сложный способ получения гормона был необходим, так как соматостатин,
синтезированный в виде свободных молекул, быстро деградирует под действием
бактериальных протеаз.
Получение соматотропина – гормона роста из передней доли гипофиза (вторая часть понятна)
Сначала клонировали двунитевую кДНК; далее путем
расщепления получали последовательность, кодирующую аминокислотный
порядок гормона, за исключением первых 23 аминокислот, - с фен (—NH2) до лей
(23), и синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от
первой до двадцать третьей со стартовым ATG-кодоном в начале. Затем два
фрагмента объединяли и подстраивали к паре lac-промоторов и участку
связывания рибосом.
ГРЧ в клетках Е. coli и в культуре клеток животных был получен в 1982 г Оказалось, что в бактериальных клетках возможен синтез аналогов ГРЧ.
Огромный интерес представляют выделение и синтез полипептида,
обладающего полной биологической активностью гипоталамического рилизинг-
фактора соматотропина (СТГ-РФ). Введение этого фактора способно
компенсировать недостаток соматотропина. Таким образом, наличие СТГ-РФ и
самого гормона, полученных в генетически сконструированных бактериальных
клетках, очень важно для успешного лечения заболеваний, обусловленных
недостатком этого гормона, и ряда патологических заболеваний, таких, как
некоторые формы диабета, регенерация тканей после ожогов и др.
Предполагается, что СТГ-РФ можно использовать и для увеличения массы и
роста домашних животных, так как он, не обладая видовой специфичностью,
способен стимулировать освобождение гормона роста у ряда животных.
Интерфероны (ИФН) – (понятно 50/50) - это группа белков и гликопротеинов, каждый из
которых синтезируется определенными клетками организма и выполняет
специфические функции. Известно около 20 природных ИФН, различающихся по
структуре и биологическим свойствам: α-ИФН состоит из 12 подвидов, β-ИФН -
из 3-4 подвидов, γ-ИФН - из 2-3 подвидов. Рекомбинантные ИФН также имеют
разновидности.
Продуцентом α-ИФН являются лейкоциты периферической крови
человека, которые культивируют на специальной среде в присутствии вируса -
интерфероногена. Нативный ИФН выделяют из культуральной жидкости
осаждением и хроматографией. Метод имеет ограниченное применение из-за
необходимости использования большего количества донорской крови.
β-ИФН синтезируется в культуре фибробластов (клеток соединительной
ткани человека) в присутствии в качестве интерфероногена двухцепочечной РНК.
γ-ИФИ - в культуре иммунных Т- или В-лимфоцитов, в том и другом
случае с низким выходом, поэтому производство с использованием культур
клеток человека - процесс дорогостоящий. Экономически оправдано получение
ИФН с использованием рекомбинантных культур микроорганизмов: Bacillus
subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Saccharomyces cerevisiae. Очистку ИФН
проводят методом аффинной хроматографии с использованием моноклональных
антител.
Технологическая схема получения генно-инженерных интерферонов (как
одна из возможных) принципиально сводится к следующему:
1. индукция синтеза и выделение интерфероновой мРНК из клеток,
2. получение кДНК, комплементарной интерфероновой мРНК из
лейкоцитов,
3. встраивание кДНК в плазмиду,
4. введение реконструированной плазмиды в клетки Е. coli,
5. размножение бактерий, содержащих реконструированную плазмиду, в
культуральной среде,
6. сепарирование клеток Е. coli,
7. дезинтеграция и экстракция клеток Е. coli,
8. осаждение (например, полиэтиленамином) с последующим центрифуги-
ованием,
9. высаливание интерферона из супернатанта сульфатом аммония
10. диализ осадка интерферона,
11. растворение интерферона, пропускание раствора через колонку с имму-
носорбентом (пришитыми моноклональными антителами),
12. элюция интерферона с последующей хроматографией на целлюлозном
катионообменнике.
Использование трансгенных животных и растений для
получения лекарственных препаратов белковой природы
(Информация очень понятна и интересна)
Применение методов генетической инженерии в животноводстве и
растениеводстве открывает перспективу изменения ряда свойств организма:
повышение продуктивности, резистентности к заболеваниям, увеличение
скорости роста, улучшение качества продукции и др. Животных и растения,
которые несут в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, принято
называть трансгенными, а ген, интегрированный в геном реципиента, -
трансгеном. Продукт этого гена (белок) является трансгенным. Благодаря
переносу генов у трансгенных организмов возникают новые качества, а
дальнейшая селекция позволяет закрепить их в потомстве и создавать
трансгенные линии.
Введение чужеродной ДНК животным можно осуществить разными
методами:
1) с помощью ретровирусных векторов, инфицирующих клетки эмбриона на
ранних стадиях развития перед имплантацией эмбриона в самку-реципиента;
2) микроинъекцией в увеличенное ядро спермия (мужской пронуклеус)
оплодотворенной яйцеклетки;
3) введением генетически модифицированных эмбриональных стволовых
клеток в предимплантированный эмбрион на ранних стадиях развития.
У родившихся потомков исследуют экспрессию трансгена на уровне
транскрипции и трансляции. Трансгенное потомство получают путем
использования традиционных методов разведения животных.
Эксперименты по генетической модификации многоклеточных организмов
путем введения в них трансгенов требуют много времени. Тем не менее
трансгеноз стал мощным инструментом для исследования молекулярных основ
экспрессии генов млекопитающих и их развития, для создания модельных систем,
позволяющих изучать болезни человека, а также для генетической модификации
клеток молочных желез животных с целью получения с молоком важных для
медицины белков. Был даже предложен новый термин «фарминг», относящийся к
процессу получения из молока трансгенных домашних ("pharm") животных
аутентичных белков человека или фармацевтических препаратов. Использование
молока целесообразно потому, что оно образуется в организме животного в
большом количестве и его можно надаивать по мере надобности без вреда для
животного. Вырабатываемый молочной железой и секретируемый в молоко
новый белок не должен при этом оказывать никаких побочных эффектов на
нормальные физиологические процессы, протекающие в организме трансгенного
животного, и подвергаться посттрансляционным изменениям, которые по крайней
мере близки к таковым в клетках человека. Кроме того, его выделение из молока,
которое содержит и другие белки, не должно составлять большого труда.
Молочная железа - великолепный продуцент чужеродных белков, которые
можно получать из молока и использовать в фармацевтической и пищевой
промышленности. Из молока трансгенных животных извлекают следующие
рекомбинантные белки: человеческий белок С (антитромбин), антигемофильный
фактор IX, α-1-антитрипсин, тканевой плазменный активатор, лактоферин,
сывороточный альбумин, интерлейкин-2, урокиназу и химозин.
Следует заметить, что создание клеточных культур и их выращивание в
промышленных реакторах, а также выведение трансгенных животных и их
обслуживание - дорогие и сложные процедуры. Однако трансгенные животные
легко размножаются, содержание их сравнительно дешево, что делает этих
животных хорошими продуцентами разнообразных белков с низкой стоимостью.
ПРИМЕР В России группой ученых под руководством Л. К. Эрнста получены трансгенные
овцы с геном химозина, в 1 л молока которых содержится 200 - 300 мг химозина -
основного компонента для производства сыра. Стоимость его будет в несколько
раз ниже продукта, получаемого традиционным способом из сычугов молочных
телят и ягнят. Приведены данные, свидетельствующие о высокой эффективности
производства сыра с использованием химозина молока трансгенных овец. Так, из
3 л молока трансгенной овцы можно получить достаточное количество химозина
для производства 1 т сыра из коровьего молока.
12. Использование рекомбинантных микроорганизмов
для получения коммерческих продуктов небелковой
природы.
Помимо получения белковых продуктов достижения генной инженерии
можно использовать для крупномасштабного производства различных ценных
низкомолекулярных небелковых соединений – витаминов, аминокислот,
антибиотиков и др.
Используя технологию рекомбинантных ДНК, можно направленно изменять
метаболизм микроорганизмов, вводя в них новые гены или модифицируя уже
существующие. Основной целью таких изменений является создание
рекомбинан-тного микроорганизма с новой ферментативной активностью,
способного превращать существующий субстрат в ценный продукт, который
обычно получают только сочетанием химических и микробиологических методов.
Синтез L-аскорбиновой кислоты (мне было понятно все, кроме схем)
В производстве аскорбиновой кислоты используется процесс, состоящий из 1 микро биологической реакции и 4 химических, это весьма трудоемкий процесс. Вот схема.
Было бы круто усовершенствовать этот процесс, заменив
большинство химических стадий на одну микробиологическую. К сожалению, такое культивирование имеет
свои трудности, поскольку эти микроорганизмы могут иметь разные оптимумы
температуры и рН, могут различаться также состав среды и скорость роста.
Иными словами, условия культивирования, оптимальные для одного организма,
могут быть неприемлемы для другого, что приведет к спонтанному «вымыванию»
из среды одного из них.
Поэтому наилучшим выходом из этой
ситуации было бы создание одного микроорганизма, синтезирующего все
ферменты, необходимые для превращения глюкозы в 2-KLG. Вот схема.
Erwinia herbicola осуществляет превращение D-глюкозы в 2,5-DKG в несколько стадий,
катализируемых разными ферментами, в то время как Cotynebacterium sp. для
превращения 2,5-DKG в 2-KLG необходима только одна стадия. Следовательно,
наиболее простой способ создания одного микроорганизма, способного
превращать D-глюкозу в 2-KLG, состоит в выделении гена 2,5-ОКС-редуктазы
Corynebacterium sp. и введении его в Erwinia herbicola
Таким образом, с помощью генетических манипуляций метаболические
реакции, протекающие в столь разных микроорганизмах, удалось осуществить в
одном из них. Этот гибрид приобрел способность синтезировать конечный
продукт комбинированного метаболического пути. Такой организм можно
использовать как фабрику для производства 2-KLG, заменяющую первые три
стадии в том процессе получения L-аскорбиновой кислоты, который используют
в настоящее время.
13. Использование генной инженерии для совершенствования производства антибиотиков.
С помощью генной инженерии можно не только создавать новые антибиотики, но и увеличивать эффективность синтеза уже известных. Лимитирующим фактором в промышленном производстве антибиотиков с помощью Streptomyces spp. часто является количество доступного клеткам кислорода. Вследствие плохой растворимости кислорода в воде и высокой плотности культуры Streptomyces его часто оказывается недостаточно, рост клеток замедляется и выход антибиотика снижается. Чтобы решить эту проблему, можно, во-первых, изменить конструкцию биореакторов, в которых выращивается культура Streptomyces, а во-вторых,