Файл: Наследственность с точки зрения молекулярной биологии. Строение нуклеиновых кислот. Роль нуклеиновых кислот. Понятие гена. Репликация, транскрипция, трансляция. Понятие промотора и оперона. Особенности экспрессии генов у прокариот и эукариот.docx
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 23.11.2023
Просмотров: 95
Скачиваний: 2
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы и по синтезируемому ими продукту. Технически эта процедура имеет много общего с гибридизацией. Все клеточные линии (клоны) высевают на чашки с питательной средой. Выросшие колонии переносят на фильтр, клетки лизируют, а высвободившиеся белки фиксируют на фильтре. Затем на фильтр наносят первые антитела, которые специфически связываются с данным белком (антигеном), все несвязавшиеся антитела удаляют, а фильтр помещают в раствор вторых антител, специфичных в отношении первых антител. Во многих тест-системах используют конъюгаты вторых антител с ферментом, например с щелочной фосфатазой. После отмывания фильтра добавляют бесцветный субстрат. Если вторые антитела связываются с первыми, то под действием фермента происходит гидролиз субстрата с образованием окрашенного вещества в том месте, где идет реакция. Те клетки на чашке, которые соответствуют окрашенным пятнам на фильтре, содержат или полноразмерный ген, или достаточно протяженный его участок, обеспечивающий синтез белкового продукта, узнаваемого первыми антителами. По окончании иммунологического скрининга необходимо дополнительно определить, какой именно из отобранных клонов содержит полноразмерный ген.
5. Понятие вектора. Основные типы векторов. Трансформация и трансфекция
Вектор - молекула ДНК или РНК, состоящая из двух компонентов: векторной части (носителя) и клонируемого чужеродного гена. Задача вектора – донести выбранную ДНК в клетку-рецепиент и встроить ее в геном.
Требования к вектору.
1. Вектор должен длительное время существовать в популяции клеток- хозяев, т.е. реплицироваться автономно или вместе с хромосомами клеток.
2. В любом векторе должны быть биохимические или генетические маркеры, которые позволяли бы обнаруживать его присутствие в клетках. Можно выделить 2 группы маркерных генов, позволяющие отличить трансформированные клетки:
Селективные гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам (канамицину, тетрациклину, неомицину и др.), гербицидам (у растений). Это могут быть гены ауксотрофности по какому-либо субстрату и т.д. Основной принцип работы такого маркера – способность трансформированных клеток расти на селективной питательной среде, с добавкой определенных веществ, ингибирующих рост и деление нетрансформированных, нормальных клеток.
Репортерные гены, кодирующие нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях может быть легко тестировано (гены β-глюкуронидазы (GUS), зеленого флюоресцентного белка (GFP), люциферазы (LUC), хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT).
3. Структура вектора должна допускать встраивание в нее чужеродной последовательности нуклеотидов без нарушения ее функциональной целостности. Это значит, что вектор должен содержать хотя бы один единичный сайт рестрикции.
Классификация векторов:
По области использования:
1. Клонирующие (клонирование генов, кДНК или любых фрагментов ДНК).
2. Экспрессирующие (синтез мРНК и белков).
3. Интегративные (обеспечивают интеграцию чужеродной ДНК в геном клетки или вируса)
4. Специализированные векторы (секвенирование и мутирование генов).
По происхождению:
1. Плазмидные
2. Фаговые
3. Гибридные (сочетают свойства плазмид и фагов).
По структуре ДНК:
1. Кольцевые
2. Линейные
По способу поддержания в клетке:
1. Автономные (реплицирующиеся самостоятельно)
2. Интегративные (реплицирующие в составе клеточной хромосомы
По числу молекул в клетке:
1. Малокопийные (несколько копий)
2. Мультикопийные (десятки копий).
По числу репликаторов, имеющихся в векторном геноме:
1. Моно-
2. Бирепликонные, их также называют челночными, если они могут реплицироваться в клетках различных видов
Плазмиды - внехромосомные генетические элементы про- и эукариот, способные к автономной репликации.
Самые распространенные плазмидные векторы клеток E. coli – плазмида pBR322 и ее производные. Буквы B и R указывают на авторов Ф. Боливара и Р. Родригеса. Длина плазмиды 4361 п.н. Этот вектор полностью секвенирован, содержит репликатор от плазмиды pMB1 и сохраняет от нее свойство мультикопийности (15-20 копий на клетку) и способность к амплификации в присутствии хлорамфеникола и левомицетина).
Из двух других плазмид в pBR322 переданы два гена устойчивости к антибиотикам ампициллину и тетрациклину. Гены устойчивости к антибиотикам содержат несколько единственных сайтов рестрикции. В совокупности этот вектор обладает большими возможностями для клонирования генов.
Если две или более плазмиды не могут сосуществовать в одной и той же клетке в условиях отсутствия селективного давления, то считается, что они принадлежат к одной группе несовместимости. Несовместимость плазмид обусловливается подавлением репликации одной из них или блокированием распределения дочерних молекул ДНК по клеткам перед их делением. Оба механизма действуют независимо друг от друга. Плазмиды, относящиеся к разным группам несовместимости, беспрепятственно существуют в одной клетке, независимо от числа копий (до 8-10 разных плазмид).
Одни плазмиды несут специфический сайт инициации репликации и могут реплицироваться только в клетках одного вида. У других плазмид этот сайт менее специфичен, и они реплицируются в самых разных бактериальных клетках. Соответственно различают плазмиды с узким и с широким кругом хозяев.
Различают плазмиды со строгим и ослабленным контролем репликации. Минимальный размер плазмид со строгим контролем репликации 20-30 тпн, а максимальный – на порядок больше. Плазмиды с ослабленным контролем репликации обычно невелики – не более 15-30 тпн. Строгость контроля репликации плазмид заключается в наличии у них механизма ограничения числа копий до 1-3 молекул на клетку. При переходе в стационарную фазу роста плазмиды со строгим контролем перестают реплицироваться, в то время как плазмиды с ослабленным контролем продолжают дупликацию, и их масса в клетке может достигать массы бактериальной ДНК.
Плазмиды со строгим контролем репликации способны к интеграции в бактериальную хромосому. При этом они подчиняются репликационному аппарату бактериальной хромосомы и могут неопределенно долго существовать в ее составе. Такие плазмиды получили название эписом.
Контроль числа копий осуществляет базовый репликон плазмиды (его размер около 2-3 т.п.н.), в который входят сайт начала репликации ori, сайты контроля за копийностью cop (лат) и несовместимостью inc (incompatibility), а также гены, чьи продукты функционируют на этих сайтах.
Фенотипические признаки. Плазмиды передают клеткам различные признаки: устойчивость к антибиотикам (более 20), тяжелым металлам: висмуту, кадмию, кобальту, ртути, свинцу; соединениям мышьяка, УФ-свету и т.д. Плазмиды, которые не выявляются по фенотипическим признакам, называются криптическими.
В природе плазмиды играют роль посредников, способствуя межклеточному обмену генами. Такой обмен приводит к быстрой адаптации клеток к изменяющимся факторам среды. Частота таких явлений в природе низка. Однако в последнее время она возросла, в результате чрезмерного использования в медицине антибактериальных веществ и загрязнения окружающей среды промышленными отходами. В клиниках вместо естественных чувствительных штаммов стали выделять их варианты, устойчивые к лекарственным веществам, а в местах скопления отходов и ядов были выявлены микроорганизмы, активно утилизирующие эти вещества. Плазмиды также могут вызывать изменения в составе белков внешней мебраны, что приводит к их антигенной вариации и способствует повышению устойчивости бактерий против иммунной системы животных.
Плазмида F (или фактор фертильности) представляет собой малокопийную конъюгативную эписому клеток E. coli К12, относящуюся к IncF1-группе несовместимости и обладающую строгим контролем репликации. Размер ее кольцевой ДНК составляет около 100 тпн, у нее идентифицированы около 60 генов. Попадая в клетку, эта плазмида изменяет ее свойства. Клетки приобретают чувствительность к некоторым фагам, а также становятся донорами ДНК и блокируют конъюгационный перенос в них чужой ДНК (явление поверхностного исключения). Эта плазмида может существовать как автономно в цитоплазме у F+ донора, так и встраиваться в бактериальную хромосому. Клетка после интеграции в ее хромосому F-плазмиды приобретает способность с высокой частотой ориентированно передавать свои гены в реципиенты. F-плазмиды представляют пример генной инженерии in vivo, осуществляющейся в природе с помощью плазмид.
Трансфекция и трансдукция являются двумя методами, используемыми для введения чужеродной ДНК в клетки. Как трансфекция, так и трансдукция достигаются с помощью векторов. главное отличие между трансфекцией и трансдукцией является то, что трансфекция - это перенос ДНК без использования вируса в качестве вектора, тогда как трансдукция - это перенос ДНК с использованием вирусного вектора. Трансфекция использует химические и не химические методы для передачи чужеродной ДНК в клетки. Трансформация является третьим методом переноса ДНК, при котором поглощение генетического материала происходит естественным путем через клеточную мембрану.
Трансфекция - это метод переноса гена, при котором генетический материал преднамеренно вводится в другую клетку с использованием химических, нехимических или основанных на частицах методов. Механизм трансфекции включает создание пор на клеточной мембране, что позволяет чужеродной ДНК проходить в клетку-хозяина. Типы векторов, используемых при трансфекции, представляют собой плазмиды, космиды, BAC, YAC или HAC. Основываясь на механизме создания пор, могут быть идентифицированы различные типы методов трансфекции. Три типа трансфекции - химически-опосредованная трансфекция, нехимически-опосредованная трансфекция и трансфекция на основе частиц. Трансфекция без использования химических веществ через ВАС.
Химически-опосредованная трансфекция использует фосфат кальция, катионные полимеры или липосомы. нехимическая трансфекция использует электропорацию, удаление волос, сонопорацию, оптическую трансфекцию или гидродинамическую доставку. трансфекция на основе частиц использует технику генной пушки, где чужеродная ДНК переносится с использованием наночастиц. Магнитофекция и нуклеофекция являются двумя другими методами трансфекции на основе частиц. При магнитофекции частицы, которые несут чужеродную ДНК, концентрируются в клетке-хозяине с помощью магнитного поля. При нуклеофекции тепловой шок используется для переноса чужеродной ДНК в клетку-хозяина.
Трансформация генов – это изменение генетического состава клеток путем привнесения извне чужеродного генетического материала, перенос чужеродных (природных или искусственно созданных) донорских генов в клетки-реципиенты растений, животных и микроорганизмов, и получение таким образом трансгенных организмов с новыми или усиленными свойствами и признаками.
Секундное отступление. Трансформация — не изобретение человека. Бактерии умели передавать друг другу ДНК, захватывать чужую и встраивать ее в свой геном еще задолго даже до появления вирусов. Более того, эти свойства не утрачены даже у более развитых организмов. И, что еще более интересно, природная трансформация, также известная как горизонтальный перенос генов, играет огромную роль в эволюционных механизмах. Но это весьма обширная тема.
Стоит отметить, что трансформация имеет свои особенности для растений и животных. Растительные клетки из-за плотной клеточной стенки поверх мембраны неспособны самостоятельно поглощать фрагменты чужеродной ДНК и воспроизводить их, тогда как клетки животных могут различными способами поглощать фрагменты ДНК, встраивая их в свой геном, или поддерживать их воспроизведение в цитоплазме.