6. Методы выделения трансформированных клеток (клонирование).
Клонирование генов – это процедура, включающая выделение и амплификацию отдельных генов в реципиентных клетках, про- и эукариотических. Эти клетки, содержащие нужный ген, можно использовать для получения: а) большого количества белка, кодируемого данным геном; б) большого количества самого гена в высокоочищенном виде.
Процесс клонирования генов включает в себя несколько стадий:
1. Получение необходимого гена:
а) путем расщепления геномной ДНК с помощью рестриктаз (эндонуклеазы, расщепляющие молекулу ДНК в строго определенном месте);
б) путем химического синтеза только небольших фрагментов ДНК (так как зная последовательность аминокислотных остатков в белковой молекуле, можно всегда определить последовательность нуклеотидов в фрагменте ДНК, кодирующем данный белок, в соответствии с генетическим кодом). Так, путем химического синтеза был получен ген, ответственный за синтез соматостатина;

в) из клеток организма выделяют молекулы иРНК и с помощью фермента обратной транскриптазы (РНК-зависимая ДНК-по-лимераза) снимают ДНК-копии необходимого гена. Например, из островных клеток поджелудочной железы были выделены иРНК, несущие информацию о синтезе инсулина. А из клеток, инфицированных вирусами, выделены и РНК, несущие информацию о синтезе интерферона.

Существует два подхода к клонированию ДНК:
использование бактериальных или дрожжевых клеток для размножения введенной в них чужеродной ДНК.
амплификация ДНК in vitro.
Используя микроорганизмы, можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую (библиотека кДНК).
Геномная библиотека (банк генов, клонотека) – это коллекция клонов ДНК, включающая все фрагменты, входящие в геном данного вида. Т. е. банк генов еще можно назвать набором клонированных фрагментов генома. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока.
Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами.
Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома.

---

Для создания банка генов необходимо:

• 
  выделение всей геномной ДНК
  

• 
  фрагментация ДНК рестриктазами или ультразвуком
  

• 
  Очищенные кольцевые молекулы ДНК (векторы) обрабатывают той же рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК добавляют к плазмидной в присутствии лигаз. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК
  

• 
  рекДНК вводят в бактериальные или дрожжевые клетки, где плазмида реплицируется с образованием многих копий.
  

• 
  Клонирование бактерий: каждая возникшая колония клеток представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид образует библиотеку геномной ДНК.
  

Недостаток: фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.
Достоинство: библиотека генов может храниться и использоваться неограниченно долго.
Использование:
-источник трансгенов
-источник материала для изучения структуры, функции и регуляции индивидуальных генов, структуры и функции белков
-сохранение генофонда исчезающих видов
Аналогичные коллекции, полученные из индивидуальных хромосом или их частей, называются хромосомными библиотеками.
Библиотека кДНК.
Это копии ДНК, комплементарные РНК. Т. к. кДНК получают из зрелых мРНК, прошедших процессинг, они не содержат интронов.
Библиотека кДНК отражает спектр генной активности в клетках, из которых она была выделена.
Для создания бибиотеки кДНК необходимо:
-выделить мРНК (у эукариот только мРНК содержит поли-А хвосты)
- in vitro к мРНК добавляют короткую цепь dT и проводят отжиг
- на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезируется комплементарная нить ДНК
- в щелочной среде цепь РНК расщепляется на нуклеотиды, после чего с помощью ДНК-полимеразы синтезируется комплементарная цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. Такую ДНК встраивают в плазмиды и вводят в клетки бактерий. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК).
Достоинства: кодирующая белок нуклеотидная последовательность гена ничем не прерывается.
Недостатки: гены эукариот содержат интроны, которые удаляются из транскриптной РНК перед превращением ее в матричную, после чего следует сплайсинг (сращивание). Бактериальные клетки не

---

могут осуществлять модификацию РНК, образовавшуюся путем транскрипции гена эукариотической клетки. Поэтому если необходимо получить белок путем экспрессии клонированного гена, то лучше использовать банк кДНК, полученной на основе матричной РНК.


7. Оптимизация экспрессии клонированных генов за счет сильных регулируемых промоторов или интеграции их в хромосому клетки- хозяина.

Успешное осуществление процедуры клонирования чужеродного гена в нужном организме - хозяине еще не означает, что этот ген обязательно будет эффективно экспрессирован. Это обусловлено тем, что, обычно, кодируемый этим геном белок не только не нужен клетке, но и дополнительно требует для своего синтеза энергию (АТФ) и различные метаболиты (аминокислоты, азотистые основания, моносахариды и т.д.), что замедляет или даже нарушает процессы нормального клеточного метаболизма. В то же время, чтобы получение целевого продукта было экономически оправданным, уровень его синтеза должен быть достаточно высоким. Никакой универсальной стратегии оптимизации экспрессии клонирован- ных генов не существует. Эффективность экспрессии любого чужеродного гена существенно зависит от степени родства организма донора ДНК с организмом хозяином. Несмотря на то, что многие представители как про-, так и эукариотических организмов способны к экспрессии чужеродных генов, для получения важных в коммерческом отношении продуктов с помощью технологии рекомбинантных ДНК ис­пользуют в основном Escherichia coli. Это связа­но, прежде всего, с тем, что сейчас достаточно хорошо изучены многие генетические, молекулярно-биологические, биохимические и физиологические свойства этого микроорганиз­ма. Кроме того, он достаточно хорошо культивируется в обычных условиях на дешевых и простых питательных средах и является безопасным в обращении. Помимо Escherichia coli для экспрессии некоторых клониро­ванных генов используются и другие организ­мы-хозяева: В. subtilis, дрожжи, животные, рас­тения и т. д.

Экспрессия генов при участии сильных регулируемых промоторов

Для эффективной экспрессии любого гена со­вершенно необходимо наличие сильного промотора, расположенного перед данным геном. Такой промотор имеет высокое сродство к РНК-полимеразе, поэтому прилега­ющие к нему последовательности эффективно (с высокой частотой) транскрибируются. Поэтому на первый взгляд может показаться, что наиболее подходящим условием для экспрессии клонированного гена является встраивание его в плазмиду так, чтобы он находился под контролем такого постоянно функционирующего сильного про­мотора. Однако непрерывная экспрессия чуже­родного гена может оказаться гибельной для клетки-хозяина, поскольку приводит к истоще­нию ее энергетических ресурсов и нарушению метаболизма. Такие клетки будут очень медленно размножаться или вообще не будут делиться. Кроме того, плазмиды, несущие постоянно (конститутивно) экспрессирующийся чужеродный ген, нередко утрачиваются после нескольких клеточных циклов, поскольку не содержащие их клетки (или клетки содержащие меньшее их количество) растут быстрее и со временем становятся в культуре преобладающими. Нестабильность плазмид (утрата плазмид) - это основная проблема, мешающая получению продукта, локализованного в генах плазмид, в значительных количествах. Для ее решения нужно научиться контролировать экс­прессию и управлять ей таким образом, чтобы клонированный ген экспрессировался только в определенной фазе роста клеточной культуры (конец log –фазы, const –фаза) и только в течение опре­деленного времени, а для этого нужно использо­вать не просто сильные, а сильные регулируемые промоторы. Плазмиды, сконструированные для этих целей, называются экспрессирующими векторами.

---

Регулируемые промоторы

Наиболее широко для создания экспрессирующих векторов используются следующие сильные регулируемые промоторы: промоторы lac- и trp-оперонов Е. coli; специально сконстру­ированный tac-промотор, состоящий из отдельных фрагментов lac- и trp-оперонов и ряд других. С каждым из них связываются соответствующие репрессоры, ко­торые опосредуют включение и выключение транскрипции специфических генов. В отсутствии лактозы в среде lac- промотор Е. coli находится в репрессированном состоянии и транскрипция его гена блокирована. Индукция, или включение lac- оперона происходит при добавлении в среду лактозы. Аналогично, активность trp-оперна регулируется добавлением триптофана. Другим способом регулирования экспрессии является использование термочувствительных промоторов, например промотор бактериофага рL. Белок- репрессор, блокирующий данный промотор, активен при 310С, но неактивен при 380С, следовательно, при инкубировании бактерий при 310С клонированный ген не экспрессируется и, наоборот повышение температуры вызывает инактивацию репрессора и высокий уровень синтеза нужного белка. Наличие регулируемых промоторов позволяет предотвращать преждевременный, бесконтрольный синтез неконститутивных рекомбинантных белков, который будет тормозить рост клеточной культуры в lag- и log-фазах и запускать его только после накопления необходимого, оптимального количества биомассы клеток (в стационарной фазе). Суммарная активность экспрессируемого гена возрастает с ро­стом числа копий рекомбинантной ДНК в расчете на клетку. Ис­пользуя многокопийные плазмиды, можно обеспечить сверхсинтез нужных белковых продуктов.

Интеграция чужеродной ДНК в хромосому хозяина

Наряду с достоинствами использование рекомбинантных плазмиид имеет целый ряд существенных недостатков, связанных с возможностью их утраты клетками в процессе длительного культивирования. Это обусловлено тем, что при наличии в клетке чужеродной химерной плазмиды часть энергети­ческих и материальных (аминокислоты, нуклеотиды) ресурсов расходуется на ее репликацию, транскрипцию и синтез чужеродных белков, которые она ко­дирует. Чем больше количество таких плазмид в клетке, тем больше клеточных ресурсов уходит на обеспечение процессов не нужных для ее нормальной жизнедеятельности. Поэтому в процессе роста популяции, клетки содержащие меньшее количество плазмид или потерявшие их совсем растут и размножаются бы­стрее тех, в которых они сохранились на прежнем уровне, и, в конеч­ном счете, оказываются в культуре преобладаю­щими. Разработано, по крайней мере, два подхода к решению этой про­блемы. В лабораторных условиях для сохране­ния рекомбинантных плазмид клетки выращивают в присутствии антибиотиков или метаболитов, обеспечиваю­щих рост только тех клеток, в которых есть такие плазмиды. (но это дорого). Особенно важно, что­бы клонированные гены сохранялись, не передаваясь другим микроор­ганизмам за счет коньюгации плазмид, в том случае, когда сконструирован­ный микроорганизм предназначен для исполь­зования вне стен лаборатории. Он должен не только оставаться эффективным, но и быть эко­логически безопасным. Методом, позволяюшим избежать утраты или нежелательной коньюгации клонируемого гена является включение клониро­ванной ДНК непосредственно в хромосомную ДНК хозяйского организма. При встраивании нужного гена в хромосом­ную ДНК хозяина нужно позаботиться о том, чтобы сайт интеграции не находился внутри ге­на, кодирующего важную клеточную функцию. Для этого чужеродный ген включают в заведомо несущественный участок. Кроме того, для обеспе­чения эффективной экспрессии его помещают под контроль регулируемого промотора. Для ин­теграции в нужный сайт вводимый ген должен содержать нуклеотидную последовательность длиной не менее 50 нуклеотидов, сходную с та­ковой в хромосомной ДНК, в пределах которых и должен произойти физический обмен (реком­бинация) между двумя молекулами ДНК.

---

8. Методы стабилизации клонированных белков. Химерные белки. Проблемы, возникающие при использовании химерных белков. Очень часто, даже после успешного клонирования и подбора эффективных условий для экспрессии, чужеродные белки, особенно не­большие, обнаруживаются в клетках лишь в минимальных коли­чествах. Такой кажущийся низкий уровень экс­прессии кодирующих их генов во многих случа­ях объясняется быстрой деградацией этих чужеродных белков в хозяйских клетках. Один из способов решения этой проблемы состоит в ковалентном присое­динении продукта клонированного гена к како­му-нибудь стабильному белку клетки-хозяина. В составе подобной конструкции, получившей название «химерный белок», продукт клониро­ванного гена оказывается защищенным от рас­щепления протеазами хозяйской клетки, что было показано в ходе экспериментов. Слияние белков программируется на уровне ДНК лигированием кодирующих участков соот­ветствующих генов. Другим способом стабилизации белков является включение, генно- инженерными методами, в целевые белки нескольких дополнительных аминокислот в определенной последовательности (маркерные пептиды), которые обычно присоединяют к N-концу полипептидной цепи. Однако этот способ не всегда эффективен. Перспективным является так же использование мутантных штаммов с искусственно вызванным дефицитом протеолитических ферментов. И, наконец эффективным способом сохранения клонированных белков является стимулирование их эффективной секреции из клетки.

Расщепление химерных белков

Из-за присутствия фрагмента хозяйского белка большинство химерных белков оказываются непригодными для применения в клинике в следствии высокой алергенности или низкой активности. Кроме то­го, для химерных белков предусмотрена более сложная процедура тестирования, которую они должны пройти, чтобы получить разрешение к применению у соответствующих организаций. Все это заставляет искать способы удаления лишних аминокислотных последовательностей из молекулы получаемого продукта. Один из таких способов основан на присоединении бел­ка, кодируемого геном-мишенью, к белку клет­ки-хозяина через короткий полипептид, распознаваемый специфической протеазой не­бактериального происхождения. Такое присое­динение тоже программируется на уровне ДНК. Олигонуклеотидные линкеры, несущие сайты для протеаз, можно пришить к клонированному гену до того, как такая конструкция будет введе­на в экспрессирующую векторную систему сли­яния. Химерные белки используются не только для стабилизации полипептидов, но и для упроще­ния процедуры очистки рекомбинантных белков. Так, плазмидная конструкция Saccharomyces cerevisiae, содержащая ген челове­ческого интерлейкина-2 с присоединенным к не­му сегментом ДНК, кодирующим маркер-ный пептид Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-, выполняет двоя­кую функцию: обеспечивает стабилизацию про­дукта гена интерлейкина-2 и облегчает его очист­ку.

---

Смотрите также файлы

• Жасы 3 Жынысы ыз Туан кні, айы, жылы.docx

• Ссиональная направленность преподавания истории как инструмент для формирования у обучающихся мотивации к будущей профессиональной деятельности.docx

• Отчет по производственной практике по профессиональному модулю пм. 07 Соадминистрирование баз данных и серверов.docx

• Согласие на обработку персональных данных я.docx

• Описание содержания.docx