Файл: Научноисследовательская работа студентки 4 курса Направления подготовки 06. 03. 01 Биология Профиль Биохимия.docx

Стремительный прогресс в области рентгеноструктурного анализа начался в 1953 г. с разработки Перуцем метода изоморфного замещения (введение атомов тяжелых металлов в молекулы кристаллических белков). Этот прием позволил использовать рентгеноструктурный анализ для исследования белка гемоглобина.

Пока Перуц разбирался с молекулой гемоглобина, Кендрю успешно применил его метод тяжелых атомов для изучения структуры сравнительно простого белка миоглобина кашалота.

В ранних работах по изучению структуры гемоглобина Перуц получал проекции молекул на плоскости. Однако, как писал впоследствии Кендрю [1], анализ таких изображений, являвшихся по существу лишь силуэтами очень сложных молекул, давал мало сведений об их структуре. Было очевидно, что при дальнейшем использовании метода необходимо ввести в него такие усовершенствования, которые бы позволяли исследовать структуры в системе трех координат.

В результате работы с миоглобином при использовании метода изоморфного замещения Кендрю в 1957 г. на основе рентгеноструктурного анализа впервые получил трехмерную модель этой молекулы с разрешение до 6 Ȧ. Хотя такое разрешение было недостаточным для выявления боковых цепей и даже конфигурации самой полипептидной цепи, оно давало картину общего расположения полипептидной цепи и группы гема, другими словами, позволяло определить в общем виде третичную структуру молекулы. Как вспоминал позднее Кендрю, "мы увидели нечто, чего никто ранее не увидел… Это была трехмерная структура молекулы белка во всей ее сложности" [2].

Применив для обработки результатов анализа ЭВМ, в 1959 г. Кендрю расшифровал пространственное строение молекулы миоглобина. Он построил также модель, дающую представление о положении большинства из 2500 атомов этой молекулы.

Между тем, продолжая свои исследования, Перуц с сотрудниками получил также трехмерное изображение молекулы гемоглобина лошади с разрешением до 5,5 Ȧ. Расшифровка структуры этой более крупной белковой молекулы была значительно облегчена результатами, полученными при изучении третичной структуры миоглобина кашалота. Оказалось, что структура миоглобина чрезвычайно близка к третичной структуре каждой из четырех субъединиц гемоглобина. Вот как об этом вспоминал сам Перуц: "Летом 1959 года, почти через 22 года после того, как я получил первую рентгенограмму гемоглобина, мы смогли наконец построить трехмерную карту электронной плотности гемоглобина с разрешающей способностью 5,5 ангстрем, подобно той, которая на два года раньше была получена для миоглобина. И как только цифры со счетчика были перенесены на контурную карту, мы убедились в том, что каждая из четырех цепей гемоглобина по форме очень напоминает единственную цель миоглобина. Бета-цепь и миоглобин были вообще идентичны, а альфа-цепь отличалась от них лишь более коротким поперечником одной маленькой петли. Миоглобин был экстрагирован Кендрю из мышц кашалота. Гемоглобин был получен из крови лошадей. Позднейшие исследований показали, что миоглобин тюленя и лошади, гемоглобин человека и коровы имеют также сходное строение" [3].

---

Молекулы гемоглобина человека состоят из плотно упакованных протеинов, состоящих из симметричных спаренных димерных полипептидных цепей: альфа и бетаглобинов, в тетрамерных структурно-функциональных единицах. Альфа2/бета2 молекулярные формы основные структурные единицы гемоглобина взрослого человека. Основная функция гемоглобина у млекопитающих транспорт кислорода от легких к тканям; он вовлечен в специфический транспорт трех других газов: углекислого газа, монооксида углерода (угарного газа) и нитрида азота (NO).

Функциональное значение гемоглобина главным образом определяется особенностью крепления аминокислотных цепей в глобиновых белках, включающих 7 витков в альфа цепи и 8 витков в бета цепи (рисунок 2).



Рисунок 2 Рентгеноструктурный анализ молекулы гемоглобина, показывающий ее высокую компактность в эритроците

На рисунке 2 под буквой А изображено положение β-спирали (показано в виде трубок) в каждой β-единице одна слева и одна повернута на 180°, справа показано, как 4 гемовых группы с атомами железа связывают молекулы газа. Также показано место серповидной мутации в мутантной β-глобиновой цепи и цистеин в 93 положении. Молекулы гемоглобина в эритроцитах, как показано на вставке справа, плотно упакованы (концентрация 34 г/дЛ) и мало контактируют с растворителем. Это позволяет кислороду не только эффективно перемещаться в каждой клетке, но и влиять на химический состав молекулы. Например, полимеризации гемоглобина в серповидной клетке при незначительной деоксигенации, на рисунке под буквой В показаны изменения четвертичной структуры гемоглобина в тетрамере при переходе от окси конформации (слева) к дезокси конформации (справа). Атомы железа смещены относительно плоскости групп гемма и центральная полость между β-цепями, открываясь, облегчает связи с 2.3 BPG.

Молекулярный кислород (газообразный или жидкий) парамагнитное вещество, в каждой молекуле О₂ имеется по 2 неспаренных электрона. Этот факт можно объяснить тем, что в молекуле на каждой из двух разрыхляющих орбиталей находится по одному неспаренному электрону. Энергия диссоциации молекулы О₂ на атомы довольно высока и составляет 493,57 кДж/моль.

В свободном виде встречается в виде двух модификаций О₂ ("обычный" кислород) и О₃

---

(озон). О₂ газ без цвета и запаха. При нормальных условиях плотность газа кислорода 1,42897 кг/м3. Температура кипения жидкого кислорода (жидкость имеет голубой цвет) равна -182,9°C. При температурах от -218,7°C до -229,4°C существует твердый кислород с кубической решеткой (-модификация), при температурах от -229,4°C до -249,3°C -модификация с гексагональной решеткой и при температурах ниже -249,3°C кубическая -модификация. При повышенном давлении и низких температурах получены и другие модификации твердого кислорода.

При 20°С растворимость газа О₂: 3,1 мл на 100 мл воды, 22 мл на 100 мл этанола, 23,1 мл на 100 мл ацетона. Существуют органические фторсодержащие жидкости (например, перфторбутилтетрагидрофуран), в которых растворимость кислорода значительно более высокая.

Высокая прочность химической связи между атомами в молекуле О₂ приводит к тому, что при комнатной температуре газообразный кислород химически малоактивен. В природе он медленно вступает в превращения при процессах гниения. Кроме того, кислород при комнатной температуре способен реагировать с гемоглобином крови (точнее с железом II гемма), что обеспечивает перенос кислорода от органов дыхания к другим органам.

Реакции биологического окисления, более эффективные, чем древние энергетические процессы брожения и гликолиза, снабжают живые организмы большей частью необходимой им энергии. Исключение составляют облигатные анаэробы, например, некоторые паразиты, для которых кислород является ядом. Использование кислорода, обладающего высоким окислительно-восстановительным потенциалом, в качестве конечного акцептора электронов в цепи дыхательных ферментов, привело к возникновению биохимического механизма дыхания современного типа. Этот механизм и обеспечивает энергией аэробные организмы [5].

Наличие на Земле кислорода является одним из факторов возможности существования жизни на нашей планете.

Кислород в составе воздуха через дыхательные пути попадает в легкие. Концы самых мелких бронхов в легких заканчиваются множеством тонкостенных легочных пузырьков альвеол это 500 миллионов пузырьков диаметром 0,2 мм. Здесь и происходит газообмен. Кислород из легочных пузырьков проникает в кровь, а углекислый газ из крови в легочные пузырьки.

Таким образом, венозная кровь обогащается кислородом и превращается в артериальную. Кислород связывается с гемоглобином, который содержится в эритроцитах, насыщенная кислородом кровь поступает в сердце и выталкивается в большой круг кровообращения. По нему кровь разносит кислород по всем тканям организма.

---

Поступление кислорода в ткани обеспечивает их оптимальное функционирование, при недостаточном же поступлении наблюдается процесс кислородного голодания гипоксии [6].

Переносимый кислород находится в крови в двух состояниях. Небольшая часть кислорода находится в растворенном состоянии в плазме. Коэффициент растворимости кислорода в крови невелик и составляет (при температуре 37°С и парциальном давлении кислорода 100 мм ртутного столба) 0,3 об.%. Это значит, что каждые 100 мл нормальной крови могут переносить в растворенном состоянии лишь 0,3 мл кислорода, что явно недостаточно для поддержания жизнедеятельности организма человека.

В процессе эволюции был выработан принципиально другой механизм переноса кислорода кровью. Этот механизм связан с наличием в крови специального сложного белка (хромопротеида), способного обратимо присоединять молекулярный кислород. В организме человека и высших животных таким хромопротеидом является гемоглобин, содержащийся в эритроцитах.

Гемоглобин присоединяет кислород в среде с высоким парциальным давлением кислорода и отдает кислород в среду с низким парциальным давлением. Каждый грамм гемоглобина в нормальных условиях может присоединять 1,34 мл кислорода. Поскольку нормальное содержание гемоглобина в крови составляет 145-170 г/л, то 100 мл крови могут переносить в связанном с гемоглобином состоянии 19-21 мл кислорода [7].

В данной работе проводилось, в частности, воздействие лазерным излучением на пористую среду (с гемоглобином) с высаженными на нем молекулами красителя (люминесцентной метки).

В работе [8] исследована кинетика замедленной флуоресценции, вызванной аннигиляцией триплетных возбужденных центров с мигрирующими ¹Δ_g-возбуждениями молекулярного кислорода.

Нелинейное тушение возбужденных электронных триплетных (Т) состояний молекул красителей, внедренных в кислородосодержащие матрицы, возникает в результате реакции аннигиляции Ти ¹Δ_g(О₂)-возбуждений [9]. Временнáя зависимость концентрации Т-центров n_T(t|n₀) для различных начальных плотностей n₀ этих частиц различна, и это легко обнаруживается при изменении накачки системы. Экспериментально измеряемые величины, являющиеся функциями или функционалами от n_T, сохраняют чувствительность к вариациям n

---

₀. В работах [10] и [11] подчеркивалась нетипичная форма временнóй зависимости интенсивности замедленной флуоресценции (ЗФ) I_DF(t) ряда красителей, сопровождающей Т ¹Δ_g-слияние (кумуляцию энергии). Кроме того, было установлено, что горбообразный характер кинетической кривой свечения связан с сенсибилизированным заселением ¹Δ_g состояний в реакции
(1)
В начальный момент времени концентрация ¹Δ_g -возбуждений n_Δ равна нулю, а сигнал ЗФ нарастает в течение некоторого времени t_m. В [12] показано, что временные законы n_T(t) и n_Δ(t) формируются как суперпозиции локальных кинетик, получивших специфическое развитие в пространственных областях с различной плотностью n₀. В то же время в [13], установлена возможность мгновенного (10 нс << τ_t, τ_Δ, где τ_t, τ_Δ времена жизни Т-состояния красителя и ¹Δ_g-состояния молекул О₂ соответственно) однородного измерения концентрации n_T с помощью дополнительного лазерного импульса в произвольный момент времени t₀ в результате лазероиндуцированной необратимой цепочки переходов Т₁ → Т_m ↝S_n.

3. 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10

---