Файл: Научноисследовательская работа студентки 4 курса Направления подготовки 06. 03. 01 Биология Профиль Биохимия.docx

Стремительный прогресс в области рентгеноструктурного анализа начался в 1953 г. с разработки Перуцем метода изоморфного замещения (введение атомов тяжелых металлов в молекулы кристаллических белков). Этот прием позволил использовать рентгеноструктурный анализ для исследования белка гемоглобина.Пока Перуц разбирался с молекулой гемоглобина, Кендрю успешно применил его метод тяжелых атомов для изучения структуры сравнительно простого белка миоглобина кашалота.В ранних работах по изучению структуры гемоглобина Перуц получал проекции молекул на плоскости. Однако, как писал впоследствии Кендрю [1], анализ таких изображений, являвшихся по существу лишь силуэтами очень сложных молекул, давал мало сведений об их структуре. Было очевидно, что при дальнейшем использовании метода необходимо ввести в него такие усовершенствования, которые бы позволяли исследовать структуры в системе трех координат.В результате работы с миоглобином при использовании метода изоморфного замещения Кендрю в 1957 г. на основе рентгеноструктурного анализа впервые получил трехмерную модель этой молекулы с разрешение до 6 Ȧ. Хотя такое разрешение было недостаточным для выявления боковых цепей и даже конфигурации самой полипептидной цепи, оно давало картину общего расположения полипептидной цепи и группы гема, другими словами, позволяло определить в общем виде третичную структуру молекулы. Как вспоминал позднее Кендрю, "мы увидели нечто, чего никто ранее не увидел… Это была трехмерная структура молекулы белка во всей ее сложности" [2].Применив для обработки результатов анализа ЭВМ, в 1959 г. Кендрю расшифровал пространственное строение молекулы миоглобина. Он построил также модель, дающую представление о положении большинства из 2500 атомов этой молекулы.Между тем, продолжая свои исследования, Перуц с сотрудниками получил также трехмерное изображение молекулы гемоглобина лошади с разрешением до 5,5 Ȧ. Расшифровка структуры этой более крупной белковой молекулы была значительно облегчена результатами, полученными при изучении третичной структуры миоглобина кашалота. Оказалось, что структура миоглобина чрезвычайно близка к третичной структуре каждой из четырех субъединиц гемоглобина. Вот как об этом вспоминал сам Перуц: "Летом 1959 года, почти через 22 года после того, как я получил первую рентгенограмму гемоглобина, мы смогли наконец построить трехмерную карту электронной плотности гемоглобина с разрешающей способностью 5,5 ангстрем, подобно той, которая на два года раньше была получена для миоглобина. И как только цифры со счетчика были перенесены на контурную карту, мы убедились в том, что каждая из четырех цепей гемоглобина по форме очень напоминает единственную цель миоглобина. Бета-цепь и миоглобин были вообще идентичны, а альфа-цепь отличалась от них лишь более коротким поперечником одной маленькой петли. Миоглобин был экстрагирован Кендрю из мышц кашалота. Гемоглобин был получен из крови лошадей. Позднейшие исследований показали, что миоглобин тюленя и лошади, гемоглобин человека и коровы имеют также сходное строение" [3].

---

Молекулы гемоглобина человека состоят из плотно упакованных протеинов, состоящих из симметричных спаренных димерных полипептидных цепей: альфа и бетаглобинов, в тетрамерных структурно-функциональных единицах. Альфа2/бета2 молекулярные формы основные структурные единицы гемоглобина взрослого человека. Основная функция гемоглобина у млекопитающих транспорт кислорода от легких к тканям; он вовлечен в специфический транспорт трех других газов: углекислого газа, монооксида углерода (угарного газа) и нитрида азота (NO).Функциональное значение гемоглобина главным образом определяется особенностью крепления аминокислотных цепей в глобиновых белках, включающих 7 витков в альфа цепи и 8 витков в бета цепи (рисунок 2).Рисунок 2 Рентгеноструктурный анализ молекулы гемоглобина, показывающий ее высокую компактность в эритроцитеНа рисунке 2 под буквой А изображено положение β-спирали (показано в виде трубок) в каждой β-единице одна слева и одна повернута на 180°, справа показано, как 4 гемовых группы с атомами железа связывают молекулы газа. Также показано место серповидной мутации в мутантной β-глобиновой цепи и цистеин в 93 положении. Молекулы гемоглобина в эритроцитах, как показано на вставке справа, плотно упакованы (концентрация 34 г/дЛ) и мало контактируют с растворителем. Это позволяет кислороду не только эффективно перемещаться в каждой клетке, но и влиять на химический состав молекулы. Например, полимеризации гемоглобина в серповидной клетке при незначительной деоксигенации, на рисунке под буквой В показаны изменения четвертичной структуры гемоглобина в тетрамере при переходе от окси конформации (слева) к дезокси конформации (справа). Атомы железа смещены относительно плоскости групп гемма и центральная полость между β-цепями, открываясь, облегчает связи с 2.3 BPG.Молекулярный кислород (газообразный или жидкий) парамагнитное вещество, в каждой молекуле О₂ имеется по 2 неспаренных электрона. Этот факт можно объяснить тем, что в молекуле на каждой из двух разрыхляющих орбиталей находится по одному неспаренному электрону. Энергия диссоциации молекулы О₂ на атомы довольно высока и составляет 493,57 кДж/моль.В свободном виде встречается в виде двух модификаций О₂ ("обычный" кислород) и О₃

---

(озон). О₂ газ без цвета и запаха. При нормальных условиях плотность газа кислорода 1,42897 кг/м3. Температура кипения жидкого кислорода (жидкость имеет голубой цвет) равна -182,9°C. При температурах от -218,7°C до -229,4°C существует твердый кислород с кубической решеткой (-модификация), при температурах от -229,4°C до -249,3°C -модификация с гексагональной решеткой и при температурах ниже -249,3°C кубическая -модификация. При повышенном давлении и низких температурах получены и другие модификации твердого кислорода.

При 20°С растворимость газа О₂: 3,1 мл на 100 мл воды, 22 мл на 100 мл этанола, 23,1 мл на 100 мл ацетона. Существуют органические фторсодержащие жидкости (например, перфторбутилтетрагидрофуран), в которых растворимость кислорода значительно более высокая.

Высокая прочность химической связи между атомами в молекуле О₂ приводит к тому, что при комнатной температуре газообразный кислород химически малоактивен. В природе он медленно вступает в превращения при процессах гниения. Кроме того, кислород при комнатной температуре способен реагировать с гемоглобином крови (точнее с железом II гемма), что обеспечивает перенос кислорода от органов дыхания к другим органам.

Реакции биологического окисления, более эффективные, чем древние энергетические процессы брожения и гликолиза, снабжают живые организмы большей частью необходимой им энергии. Исключение составляют облигатные анаэробы, например, некоторые паразиты, для которых кислород является ядом. Использование кислорода, обладающего высоким окислительно-восстановительным потенциалом, в качестве конечного акцептора электронов в цепи дыхательных ферментов, привело к возникновению биохимического механизма дыхания современного типа. Этот механизм и обеспечивает энергией аэробные организмы [5].

Наличие на Земле кислорода является одним из факторов возможности существования жизни на нашей планете.

Кислород в составе воздуха через дыхательные пути попадает в легкие. Концы самых мелких бронхов в легких заканчиваются множеством тонкостенных легочных пузырьков альвеол это 500 миллионов пузырьков диаметром 0,2 мм. Здесь и происходит газообмен. Кислород из легочных пузырьков проникает в кровь, а углекислый газ из крови в легочные пузырьки.

Таким образом, венозная кровь обогащается кислородом и превращается в артериальную. Кислород связывается с гемоглобином, который содержится в эритроцитах, насыщенная кислородом кровь поступает в сердце и выталкивается в большой круг кровообращения. По нему кровь разносит кислород по всем тканям организма.

---

Поступление кислорода в ткани обеспечивает их оптимальное функционирование, при недостаточном же поступлении наблюдается процесс кислородного голодания гипоксии [6].Переносимый кислород находится в крови в двух состояниях. Небольшая часть кислорода находится в растворенном состоянии в плазме. Коэффициент растворимости кислорода в крови невелик и составляет (при температуре 37°С и парциальном давлении кислорода 100 мм ртутного столба) 0,3 об.%. Это значит, что каждые 100 мл нормальной крови могут переносить в растворенном состоянии лишь 0,3 мл кислорода, что явно недостаточно для поддержания жизнедеятельности организма человека.В процессе эволюции был выработан принципиально другой механизм переноса кислорода кровью. Этот механизм связан с наличием в крови специального сложного белка (хромопротеида), способного обратимо присоединять молекулярный кислород. В организме человека и высших животных таким хромопротеидом является гемоглобин, содержащийся в эритроцитах.Гемоглобин присоединяет кислород в среде с высоким парциальным давлением кислорода и отдает кислород в среду с низким парциальным давлением. Каждый грамм гемоглобина в нормальных условиях может присоединять 1,34 мл кислорода. Поскольку нормальное содержание гемоглобина в крови составляет 145-170 г/л, то 100 мл крови могут переносить в связанном с гемоглобином состоянии 19-21 мл кислорода [7].В данной работе проводилось, в частности, воздействие лазерным излучением на пористую среду (с гемоглобином) с высаженными на нем молекулами красителя (люминесцентной метки).В работе [8] исследована кинетика замедленной флуоресценции, вызванной аннигиляцией триплетных возбужденных центров с мигрирующими ¹Δ_g-возбуждениями молекулярного кислорода.Нелинейное тушение возбужденных электронных триплетных (Т) состояний молекул красителей, внедренных в кислородосодержащие матрицы, возникает в результате реакции аннигиляции Ти ¹Δ_g(О₂)-возбуждений [9]. Временнáя зависимость концентрации Т-центров n_T(t|n₀) для различных начальных плотностей n₀ этих частиц различна, и это легко обнаруживается при изменении накачки системы. Экспериментально измеряемые величины, являющиеся функциями или функционалами от n_T, сохраняют чувствительность к вариациям n

---

₀. В работах [10] и [11] подчеркивалась нетипичная форма временнóй зависимости интенсивности замедленной флуоресценции (ЗФ) I_DF(t) ряда красителей, сопровождающей Т ¹Δ_g-слияние (кумуляцию энергии). Кроме того, было установлено, что горбообразный характер кинетической кривой свечения связан с сенсибилизированным заселением ¹Δ_gсостояний в реакции (1)В начальный момент времени концентрация ¹Δ_g-возбуждений n_Δ равна нулю, а сигнал ЗФ нарастает в течение некоторого времени t_m. В [12] показано, что временные законы n_T(t) и n_Δ(t) формируются как суперпозиции локальных кинетик, получивших специфическое развитие в пространственных областях с различной плотностью n₀. В то же время в [13], установлена возможность мгновенного (10 нс << τ_t, τ_Δ, где τ_t, τ_Δ времена жизни Т-состояния красителя и ¹Δ_g-состояния молекул О₂ соответственно) однородного измерения концентрации n_Tс помощью дополнительного лазерного импульса в произвольный момент времени t₀ в результате лазероиндуцированной необратимой цепочки переходов Т₁ → Т_m ↝S_n.

3. 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10

---