Файл: Изучение молекулярных предикторов сосудистого риска опосредованного эндотелиальной дисфункцией у людей с сахарным диабетом 2 типа.docx

Для того чтобы определить внутриклеточные мишени МДА и МГО, были использованы вестерн-блоттинг и специальные антитела, реагирующие со связанными с белками радикалами МДА или МГО. В клетках EA.hy926 были обнаружены три основных и несколько минорных белков, модифицируемых МДА и МГО [44]. Они соответствовали мажорным белкам в клеточных экстрактах, но отличались между собой. Если МДА в основном модифицировал белки с массами около 50, 200 и >250 кДа, то МГО – белки с массами около 50, 65 и 150 кДа. Таким образом, профили МДА- и МГО-меченных белков по большей части различны и могут отражать модификацию разных клеточных белков.

Пилотный анализ активности инсулинового каскада в клетках EA.hy926 не выявил существенных изменений в степени фосфорилирования мишеней инсулинового каскада (белки IRS, Akt и eNOS) ни в условиях дислипидемии, ни в условиях карбонильного стресса, связанного с гипергликемией и вызванного ГО или МГО. Вместе с тем, в отличие от ГО и МГО, МДА явно оказывал стрессовое воздействие, которое отражалось на активации стрессзависимых р38 МАР-киназ. Эти данные означают, что внутриклеточный механизм действия МДА скорее всего связан с прямым воздействием на белки цитоскелета, а не с нарушением работы сигнальных каскадов.

В совокупности представленные результаты свидетельствуют о большой вероятности нарушения барьерной функции эндотелия уже на ранних этапах патогенеза СД2 за счет карбонильного стресса, который опосредован МДА при дислипидемии и ожирении. Молекулярный механизм действия МДА связан, по-видимому, с ковалентной модификацией белков, в том числе цитоскелета, а не с нарушением активности сигнальных каскадов клетки. Клеточный механизм действия МДА связан с изменением структуры цитоскелета, что ведет к нарушению краевой активности цитоплазмы, дестабилизации межклеточных контактов и усилению проницаемости эндотелиального монослоя.

---

ИНСУЛИНОВАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ, АДИПОГЕННАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА И ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ФАКТОР PREP1

Чувствительность к инсулину контролируется в клетках на разных уровнях. Если посттрансляционные модификации и белок-белковые взаимодействия реализуют быстрые изменения активности инсулинового каскада, то транскрипционные факторы контролируют долгосрочные изменения экспрессии белков на транскрипционно-трансляционном уровне. В поиске новых терапевтических мишеней мы определили, что транскрипционный фактор Prep1 TALE-семейства гомеобоксных регулирует чувствительность к инсулину.

Искусственное снижение экспрессии Prep1 в модельных преадипоцитах мыши 3T3-L1 значительно ускоряло дифференцировку клеток в зрелые адипоциты, тогда как повышение экспрессии тормозило адипогенез [21, 45]. Полногеномный анализ показал, что снижение экспрессии Prep1 переводит клетки 3T3-L1 в преактивированное состояние, изменяя экспрессию значительной части генов, важных для адипогенной дифференцировки. Prep1 оказывал сходный эффект при разных комбинациях дифференцировочных агентов, что свидетельствует о действии Prep1 на уровне генома, а не на уровне отдельных белков или сигнальных каскадов. Сходные результаты были получены в первичной культуре клеток из жировой ткани мышей с пониженной экспрессией Prep1.

Клетки со сниженной экспрессией Prep1 имели также повышенную чувствительность инсулинового каскада. Исследуя механизм, мы выяснили, что Prep1 подавляет экспрессию инсулинзависимого транспортера глюкозы Glut4. Таким образом, Prep1 контролирует два ключевых процесса в патогенезе СД2, такие как ИР и адипогенез, являясь потенциальной терапевтической мишенью.

Полногеномный анализ взаимодействия Prep1 с ДНК в клетках 3T3-L1 показал, что Prep1 связывается как с ранее установленными мишенями, общими для различных клеток, так и с генами-мишенями, специфичными для адипоцитов. Среди последних, составляющих больше половины всех генов-мишеней Prep1, были выявлены гены, играющие важную роль в адипогенной дифференцировке, такие как Cebpa, Cebpd и Lama4. Prep1 непосредственно связывался с промоторами этих генов, регулируя их экспрессию. При этом Prep1 влиял на формирование многокомпонентных комплексов, связывающих активные участки хроматина («hotspots»). Это значит, что механизм действия Prep1 связан с другими партнерами, которые могут также являться потенциальными терапевтическими мишенями.

---

Детализируя механизм действия Prep1, мы обнаружили, что он избирательно влияет на модификации хроматина. Так, Prep1 значительно изменял метилирование лизина-4, но не влиял на ацетилирование лизина-27 в гистоне 3. Это говорит о том, что Prep1 не изменяет распределения активных энхансеров в преадипоцитах, но может влиять на их «отложенную» активность вследствие дополнительных модификаций, которые могут проявляться под действием других стимулов [45].

Известно, что на системном уровне ИР проявляется в снижении инсулинзависимого захвата глюкозы из кровотока и усилении синтеза глюкозы de novo в печени. Для того чтобы исследовать функции Prep1 в печени, мы использовали трансгенных мышей с печеньспецифическим нокаутом гена Prep1. Выделенные из них гепатоциты имели повышенную чувствительность к инсулину и, соответственно, сниженную активность глюконеогенеза. Анализируя механизм этого явления, мы выяснили, что Prep1 контролирует экспрессию двух ключевых ферментов глюконеогенеза, фосфоенолпируват карбоксикиназы (Pepck) и глюкозо-6-фосфатазы (G6pc). При этом действие Prep1 было опосредовано Wnt-сигнальным каскадом, поскольку изменялся уровень β-катенина, отвечающего за ядерную локализацию белковых комплексов, содержащих мастер-регулятор глюконеогенеза Foxo1 [46, 47]. Как следствие, внутриклеточная локализация и стабильность Foxo1 изменялись при нокауте Prep1. Поскольку Foxo1 является одной из основных мишеней Akt в контексте инсулинового каскада, эти результаты указывают на функцию Prep1 как ключевого транскрипционного регулятора инсулинового каскада.

ИНСУЛИНОВАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ, ЛИПОДИСТРОФИЯ И МУТАЦИИ ГЕНОВ

Наследственные липодистрофии представляют собой гетерогенную группу редких заболеваний, характеризующихся полной или частичной потерей подкожной жировой клетчатки, а также ее неправильным перераспределением, что отличает эту группу заболеваний от ожирения. Однако, так же как и ожирение, эти заболевания сопровождаются различными метаболическими нарушениями: ИР и сахарным диабетом, жировым гепатозом и стеатогепатитом, дислипидемией, артериальной гипертензией. Проведено молекулярно-генетическое исследование у 58 пациентов (45 взрослых и 13 детей) из 51 семьи с клинической картиной различных форм липодистрофий и ИР с использованием высокопроизводительного параллельного секвенирования (платформа Ion Torrent) панели Custom Ion Ampliseq, включавшей праймеры для мультиплексной амплификации следующих 18 генов, ассоциированных с развитием липодистрофии и инсулинорезистентности: AGPAT2, BSCL2, CAV1, PTRF, PSMB8, LMNA, PPARG, PLIN1, AKT2, CIDEC, LIPE, LMNB2, PIK3CA, PPP1R3A, POLD1, WRN, ZMPSTE24, BANF1 [48]. Биоинформатическая обработка данных секвенирования проводилась с использованием пакета программ ANNOVAR (http://annovar.openbioinformatics.org).

---

Впервые в России проведено исследование наследственных липодистрофий не только с клинических, но и с молекулярно-генетических позиций. Помимо этого, нами впервые для диагностики различных форм липодистрофии применен метод секвенирования нового поколения с помощью специально созданной панели из 18 генов-кандидатов. Впервые в России описаны семьи с выраженной ИР и семейной парциальной липодистрофией 2 типа вследствие мутации R482W в гене LMNA [49] и 3 типа вследствие мутации R212Q в гене PPARG [50]. Следует заметить, что мутация R482W гена LMNA оказалась наиболее частой причиной парциальной липодистрофии в исследуемой популяции (у 7 пациентов из 3 семей из 40 пациентов с парциальной липодистрофией, 17,5%). Впервые в мире липодистрофия описана как возможное клиническое проявление аутоиммунного полигландулярного синдрома 1-го типа [51]. Данное наблюдение также демонстрирует, что ИР в общем и липодистрофия в частности могут встречаться при многих эндокринных и аутоиммунных заболеваниях. Впервые в России описано разнообразие эндокринной патологии при синдроме Вернера вследствие мутаций в гене WRN (на примере 3 пациентов). В результате изучения молекулярно-генетических основ ИР и липодистрофии совместно с зарубежными соавторами описана новая форма генерализованной липодистрофии, ассоциированной с прогероидным синдромом вследствие мутации T10I в гене LMNA, отличающаяся от других прогероидных синдромов выраженными проявлениями ИР и связанных с ней метаболических нарушений [52].

Впервые в России изучены и проанализированы клинико-лабораторные данные пациентов с различными формами наследственных липодистрофий (парциальными липодистрофиями, генерализованными липодистрофиями и прогероидными синдромами).

Результаты проведенного исследования также легли в основу международного консенсуса по диагностике и лечению различных форм липодистрофий, опубликованного в 2016 г. [53]. Наше исследование показало, что при проведении диагностики и дифференциальной диагностики различных форм наследственных липодистрофий важное значение имеет генетическое исследование, предпочтительно методом секвенирования нового поколения. И хотя жесткие критерии клинической диагностики липодистрофии еще не найдены, совместно, в том числе на основании полученных нами данных, были предложены клинические параметры, увеличивающие подозрение на наличие липодистрофии:

---

выраженность скелетной мускулатуры, флебомегалия, выраженный acanthosis nigricans, прогероидные черты, неалкогольная жировая болезнь печени, синдром поликистозных яичников, гипертриглицеридемия, сахарный диабет с потребностью в инсулине более 2 ЕД/кг/сут. На основании полученных данных также был предложен алгоритм диагностики различных форм липодистрофий [48].

---