Файл: Коронавирусы.pdf

Информация подготовлена на основе материалов ВОЗ, размещенных по адресу:
https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/situation-reports/20200307-sitrep-47-covid-
19.pdf?sfvrsn=27c364a4_2

присутствует у людей в эпителии тонкой кишки и повсеместно присутствует в эндотелиальных клетках. Сделано предположение, что высокий уровень репликации коронавируса в альвеолах легких приводит к разрушению альвеолярного сосуда и последующему попаданию вируса в кровоток, через который вирус распространяется по всему телу.
(Weilie Chen, Yun Lan, Xiaozhen Yuan, Xilong
Deng, Yueping Li, Xiaoli Cai, Liya Li, Ruiying He, Yizhou Tan, Xizi Deng, Ming Gao, Guofang Tang, Lingzhai Zhao, Jinlin Wang, Qinghong Fan,
Chunyan Wen, Yuwei Tong, Yangbo Tang, Fengyu Hu, Feng Li & Xiaoping Tang (2020) Detectable 2019-nCoV viral RNA in blood is a strong indicator for the further clinical severity, Emerging Microbes & Infections, 9:1, 469-473, DOI: 10.1080/22221751.2020.1732837].
Рис. 29. Диагностические праймеры для генома SARS-CoV-2. Цифрами показаны положения праймеров в соответствии с положением в геноме SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1, GenBank: MN908947.3.
(На основе источника: Dae-Gyun Ahn, Hye-Jin Shin, Mi-Hwa Kim, Sunhee Lee, Hae-Soo Kim, Jinjong Myoung, Bum-Tae Kim, and Seong-Jun Kim.
Current Status of Epidemiology, Diagnosis, Therapeutics, and Vaccines for Novel Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) // J. Microbiol.
Biotechnol. (2020), 30(3), 313–324, https://doi.org/10.4014/jmb.2003.03011)
Для диагностики COVID-19 могут быть использованы различные платформы.
Таблица 7.
Технологические платформы для диагностики COVID-19 с соответствующими типами образцов и принципами работы SARS-CoV-2
(Manish Kumar, Kaling Taki, Rohit Gahlot, Ayushi Sharma, Kiran Dhangar. A chronicle of SARS-
CoV-2: Part-I - Epidemiology, diagnosis, prognosis, transmission and treatment // Science of the Total Environment, 734 (2020) 139278 https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.139278)
Платформа
Выявление маркера
Образец
Принцип работы
Литература
CRISPR
(Clustered
Нуклеиновая
Сыворотка
Разработаны различные подходы использования CRISPR в диагностике патогенов. Например, диагностика нуклеиновых
Wang et al. (2020a)
,
Wang et al. (2020b)
,

Regularly
Interspaced Short
Palindromic
Repeats) кислота крови кислот патогенов с транс-расщеплением активных CRISPR-Cas. В отсутствие нуклеиновой кислоты-мишени нуклеаза Cas неактивна. После связывания своей крРНК с родственной мишенью (РНК для Cas13a, дцДНК для Cas12a, оцДНК для
Cas14a) нуклеаза активируется, что приводит к расщеплению мишени и каталитическому расщеплению близлежащих нуклеиновых кислот (оцРНК для Cas13a, оцДНК для Cas12a и
Cas14a. ). Эта «побочная» нуклеазная активность превращается в усиленный сигнал за счет обеспечения репортерных зондов с флуорофором.
Wang et al. (2020c)
,
Wang et al. (2020d)
RAT (Rapid
Antigen Test)
Белок
Сыворотка
Крови
Меченые золотом антитела инициируют образование колориметрического сигнала на бумаге в присутствии целевого агента.
Bosch et al. (2017)
RPA
(Recombinase
Polymerase
Amplification)
Нуклеиновая кислота
Соскобы
(нос, ректальный)
В РПА используют большой фрагмент Bsu-полимеразы, рекомбиназу и SSB-белки. Часть молекул рекомбиназы связывается с одним праймером, часть - с другим, образуя комплексы. После внесения в реакционную смесь такие комплексы сканируют ДНК в поисках комплементарных праймеру участков и, найдя их, инициируют процесс расплетения двухцепочечной молекулы и присоединения праймера. Расплетенную ДНК стабилизируют SSB-белки, после этого полимераза начинает синтез. Размер амплифицируемого фрагмента ограничивается 500 пар нуклеотидов, а минимальная длина праймера должна быть 30 нуклеотидов для повышения его специфичности. Реакция протекает очень быстро, и детектируемый уровень ДНК обычно достигается уже в течение
3-10 минут
Amer et al. (2013)
http://www.maxmedikal.
com/files/catalogs/RPA_
%D0%B1%D1%80%D0%B
E%D1%88%D1%8E%D1%
80%D0%B0_%D1%80%D1
%83%D1%81_12%20%D1
%81%D1%82%D1%80.pdf
RCA (Rolling
Circle
Amplification)
Нуклеиновая кислота
Сыворотка
Крови
RCA представляет собой изотермический ферментативный процесс, который использует ДНК- или РНК-полимеразы
(например, ДНК-полимеразу Ψ29) для получения одноцепочечных молекул ДНК (ssDNA) или РНК, которые представляют собой соединение в серии комплементарных единиц матрицы. ДНК-полимераза используется для удлинения кольцевого праймера и многократной репликации нуклеиновой последовательность.
Martel et al. (2013).
Gu L, Yan W, Liu L,
Wang S, Zhang X, Lyu
M. Research Progress on
Rolling
Circle
Amplification
(RCA)-
Based
Biomedical
Sensing.
Pharmaceuticals
(Basel). 2018;
11(2):35. doi:10.3390/ph11020035
SIMOA (Single-
Molecule Enzyme-
Linked
Immunosorbent
Assay)
Белок
Сыворотка
Крови
Технология SIMOA основана на выделении отдельных иммунокомплексов на парамагнитных шариках с использованием стандартных реагентов ELISA. Основное различие между SIMOA и обычными иммуноанализами заключается в способности улавливать отдельные молекулы в лунках размером с фемтолитр, что позволяет проводить считывание каждого отдельного шарика и определять, связан ли он с целевым аналитом или нет. Традиционные измерения
ELISA ограничены уровнями обнаружения пг / мл. RayBio
Ultrasensitive Simoa Testing Services может достигать чувствительности на уровне фемтограмма (фг / мл).
Rissin et al. (2010). https://www.raybiotech.
com/simoa-single- molecule-protein- detection/, http://www.healthtech.c om/uploadedFiles/Confe rences/White_Papers/M
XA/Scientific-
Principles-of-Simo-
Technology.pdf
NASBA (Nucleic
Acid Sequence
Based
Amplification)
Нуклеиновая кислота
Соскоб (нос) Транскрипционная амплификация для РНК-мишеней.
Амплификация последовательности нуклеиновой кислоты
(NASBA) на основе мРНК. Активность обратной транскриптазы, рибонуклеазы Н (РНКазы Н) и РНК-полимеразы
Т7 объединяются для получения новых РНК-мишеней через вновь синтезированные двухцепочечные интермедиаты ДНК.
NASBA может вызывать 10 7
-кратную амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени в течение 60 минут. Измерение мРНК может подтвердить наличие и жизнеспособность целевого организма. Поскольку NASBA исключительно амплифицирует РНК, присутствие ДНК в образцах не даст ложных срабатываний. Этот метод может быть выполнен изотермически, что уменьшает потребность в специализированном оборудовании.
Wat et al. (2008)
Danny
L. Wiedbrauk, Ann
M. Drevon, in Molecular Methods for Virus Detection,
1995

LAMP (Loop-
Mediated
Isothermal
Amplification)
Нуклеиновая кислота
Соскоб
(глотка)
Метод LAMP заключается в использовании для амплификации
ДНК четырех/шести олигонуклеотидных праймеров и большого фрагмента Bst ДНК-полимеразы, различных модификаций, обладающего сильной хеликазной активностью. Четыре праймера должны быть специфичны к участкам целевого фрагмента. Реакция протекает в изотермических условиях, так как денатурация цепей происходит за счет их смещения хеликазой.
Imai et al. (2007). https://www.skygen.co m/podderzhka/obzory/2 8_izotermicheskaya_am plifikatsiya_resheniya_o t_new_england_biolabs/
#1
RT-LAMP
(Reverse
Transcription
Loop-Mediated
Isothermal
Amplification)
Нуклеиновая кислота
Смыв
(носоглотка)
Совмещение реакции обратной транскрипции и LAMP для РНК- мишеней. В LAMP в качестве матрицы можно использовать и
РНК, если добавить в реакционную смесь ревертазу или Bst
3.0 ДНК-полимеразу, обладающую ревертазной активностью.
Shirato et al. (2007)
https://www.skygen.co m/podderzhka/obzory/2 8_izotermicheskaya_am plifikatsiya_resheniya_o t_new_england_biolabs/
#1
ELISA (Enzyme-
Linked
Immunosorbent
Assay)
Белок
Сыворотка крови
Принцип метода заключается в реакции специфического взаимодействия антигена с антителом с образованием иммунного комплекса и последующей детекции полученного комплекса с помощью спектрофотометрии, хемилюминесценции и других методик. Детекция может быть как прямой (когда исследуемое вещество само обладает ферментативной активностью, либо оно помечено ферментной меткой), так и косвенной или непрямой (когда исследуемое вещество, связавшееся с иммобилизованными на твердой фазе антителами, инкубируется с антителами, меченными ферментом).
Rowe et al. (1999).
ОФС.1.7.2.0033.15
Метод иммуноферментного анализа
Верхний предел обнаружения РНК SARS-CoV-2 (LoB) для разработанного метода qPCR, в соответствии с рекомендациями CLSI EP17-A [10], составил 2800 копий/мкл при Ct 14. Хорошую линейность (R2 ≥0,9936) наблюдали в диапазоне от приблизительно 10 7
до 10 копий/в реакции.
LoВ для данного метода, выраженное в геномных эквивалентах (ГЭ), составило 10 3
ГЭ/мл. (Ct 37).
Специфичность – 100%. Благодаря своей высокой чувствительности и специфичности наборы позволяют обнаруживать генетический материал коронавируса уже на ранних стадиях, что крайне важно для своевременного выявления заболевание и принятия экстренных противоэпидемических мероприятий.
Для обнаружения РНК SARS-CoV-2 у пациентов с COVID-19 широко используются различные варианты ПЦР тест-систем в режиме реального времени (qPCR)
(Zhai P, Ding Y, Wu X, Long J, Zhong Y, Li Y. The epidemiology, diagnosis and treatment of COVID-19. Int J Antimicrob Agents. 2020 May;55(5):105955. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2020.105955.
Epub 2020 Mar 28. PMID: 32234468).
Основные проблемы эффективного обнаружения маркеров коронавирусной инфекции связаны с наличием большого количества образцов с низкой вирусной нагрузкой, от 200 до 500 копий/мл. Как правило, это связывается с наличием проб от пациентов в инкубационном периоде и инаппарантными формами COVID-19. Попытки оценить реальное количество таких людей ранее предпринимались в Сингапуре, Тяньцзине и Германии и оно примерно составляло от 44% до 62% исследованных проб
(Yang Y, Yang M, Shen C, Wang F, Yuan J, Li J, et al.
Evaluating the accuracy of different respiratory specimens in the laboratory diagnosis and monitoring the viral shedding of 2019-nCOV infections. Https://doi.Org/10.1101/2020.02.11.20021493.2020)
. Использование dPCR для тестирования пациентов с
COVID-19 показало, что цифровой ПЦР более чувствителен и может применяться для анализа образцов с низкой вирусной нагрузкой, особенно для пациентов без клинических симптомов
(He,
X., Lau, E.H.Y., Wu, P. et al. Temporal dynamics in viral shedding and transmissibility of COVID-19. Nat Med (2020). https://doi.org/10.1038/s41591-020-0869-5
; Rothe C, Schunk M, Sothmann P, et al. Transmission of 2019-nCoV Infection 245 from an
Asymptomatic Contact in Germany. N Engl J Med 2020. DOI: 10.1056/NEJMc2001468).
Цифровая ПЦР (dPCR) - это ПЦР технология, которая разделяет реакционную смесь на большое количество меньших реакций, в каждой из которых присутствует только одна молекула нуклеиновой кислоты и таким образом можно получить данные, по конечной точке, на основе интенсивности флуоресценции для каждой индивидуальной тестируемой молекулы
(Quan P-L., Sauzade

M., Brouzes E. dPCR: A Technology Review Sensors (Basel). 2018 Apr; 18(4): 1271. Published online 2018 Apr 20. doi: 10.3390/s18041271;
Hindson BJ, Ness KD, Masquelier DA, Belgrader P, Heredia NJ, Makarewicz AJ, et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem 2011;83:8604-10; Hindson CM, Chevillet JR, Briggs HA, Gallichotte EN, Ruf IK, Hindson BJ, et al.
Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature methods 2013;10:1003-5).
Количественная оценка выполняется путем применения статистики Пуассона при расчете доли отрицательных микроячеек и положительных, которые изначально содержали более одной молекулы-мишени. dPCR обладает большей точностью чем qPCR, и его гораздо проще использовать для подсчета числа копий РНК и количественной оценки из-за бинарной природы, в которой реакционные микроячейки считаются либо положительными или отрицательными
(Vogelstein B, Kinzler KW. Digital pcr. Proc
Natl Acad Sci U S A 1999;96:9236-41)
. Кроме того, dPCR более устойчив к ингибированию в ПЦР по сравнению с qPCR
(Dingle TC, Sedlak RH, Cook L, Jerome KR. Tolerance of droplet-digital PCR VS real-time quantitative PCR to inhibitory substances.
Clinical chemistry 2013;59:1668-70; Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов для идентификации РНК коронавирусов видов 229Е, NL63, OC43, HKU1 методом гибридизационно-флуоресцентной обратно- транскриптазной полимеразной цепной реакции. Патент №2473702 от 16.11.11; Li YC, Bai WZ, Hashikawa T. The neuroinvasive potential of SARS-CoV2 may play a role in the respiratory failure of COVID-19 patients. J Med Virol. 2020 Jun;92(6):552-555. doi: 10.1002/jmv.25728.
Epub 2020 Mar 11).
У пациентов с COVID-19, в период проявления клинических симптомов заболевания, наблюдалась высокая концентрация РНК SARS-CoV-2 которая составляла более 100 копий/мкл. По мере развития заболевания и в период реконвалесценции вирусная нагрузка резко уменьшается, до >1 копии/мкл. В пробах от COVID-19 пациентов с бессимптомным течением заболевания также была обнаружена низкая концентрация РНК SARS-CoV-2, которая составляла около 1 копии/мкл.
Оценка вирусной нагрузки у пациентов может иметь большое значение для выбора стратегии лечения и проведения карантинных мероприятий. Принято считать, что qPCR, как стандартный метод обнаружения РНК SARS-CoV-2, играет важную роль в раннем выявлении
COVID-19 у пациентов
(He, X., Lau, E.H.Y., Wu, P. et al. Temporal dynamics in viral shedding and transmissibility of COVID-19. Nat Med
(2020). https://doi.org/10.1038/s41591-020-0869-5)
. Недостаточная чувствительность метода для оценки вирусной нагрузки может быть связана с рядом факторов: особенностями сбора образцов, их транспортировкой и хранением, а также техническими погрешностями при постановке ПЦР
(Lianhua
Dong, Junbo Zhou,Chunyan Niu, Quanyi Wang, Yang Pan, Xia Wang, et al. Highly accurate and sensitive diagnostic detection of SARS-CoV-2 by digital PCR. https://doi.org/10.1101/2020.03.14.20036129).
С целью уточнения полученных результатов необходимо проведение повторных тестирований. Наличие высокочувствительных и точных подтверждающих тестов принципиально важно для своевременной и эффективной диагностики
COVID-19.
В настоящее время, кроме qPCR, существуют и другие методы, такие как секвенирование следующего поколения (NGS) и обнаружение иммунологических маркеров. Выявление антивирусных IgM и IgG может также быть использовано в качестве подтверждающего метода диагностики COVID-19, вызванного SARS-CoV-2. Применение нескольких методов диагностики позволяет уменьшить количество ложноотрицательных результатов.
Однако диагностика, основанная на выявлении вирусных нуклеиновых кислот, до сих пор считается золотым стандартом. Метод цифровой ПЦР может быть важным подтверждающим тестом, который может значительно улучшить показатель выявляемости пациентов с COVID-19.
Полученные результаты по использованию dPCR для детекции РНК SARS-CoV-2 показали, что этот метод особенно подходит для выявления РНК в случае ее низкой концентрации у контактных, а также для мониторинга изменения вирусной нагрузки у выздоравливающих пациентов
(Lauer SA,
Grantz KH, Bi Q, Jones FK, Zheng Q, Meredith HR, et al. The Incubation Period of Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) From Publicly Reported
Confirmed Cases: Estimation and Application. Ann Intern Med. 2020 May 5;172(9):577-582. doi: 10.7326/M20-0504. Epub 2020 Mar 10).
Дополнительное преимущество количественного определения РНК SARS-CoV-2 заключается в том, что он позволяет количественно сравнивать результаты, полученные в разные сроки заболевания и в различных лабораториях. Количественная оценка мишеней с помощью dPCR обеспечивает высокое соответствие между различными постановками ПЦР различными операторами
(Ai T, Yang Z,