Файл: Новиков Д.К. Медицинская микробиология.pdf

Бактериофаги широко распространены в природе, их обнаруживают в воде, почве, пищевых продукта, в различных выделениях из организма человека и животных.

Морфология. Большинство фагов под электронным микроскопом напоминают по форме головастика или сперматозоида; имеют головку и отросток (рис. 8), но встречаются и другие морфологические варианты. Размеры фагов – 20-200 нм. Выделяют пять основных типов бактериофагов. К 1 типу относятся ДНК-овые фаги нитевидной формы, которые лизируют бактерии, содержащие F- или R-плазмиду; II тип – РНК-содержащие фаги с рудиментом отростка; III тип – фаги ТЗ, Т7 с коротким отростком; IV тип – фаги с несокращающимся чехлом отростка и двунитевой ДНК (Т1, Т5 и др.); V тип – ДНКсодержащие фаги с сокращающимся чехлом отростка, который заканчивается базальной пластинкой. Наиболее изучены Т-фаги (англ. type – типовые) E.coli – группа колидизентерийных фагов, включающая 7 представителей Т1-Т7.

Структура. Фаги имеют нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК) и белок. Двунитевая ДНК фагов замкнута в кольцо и упакована в головке. Некоторые фаги содержат однонитевую ДНК или РНК. Капсид головки фага образован белками по кубическому типу симметрии.

В частицах некоторых фагов под чехлом дистальной части отростка (фаг T2) содержится фермент лизоцим, АТФ-аза и ионы кальция. Внутри головки (фаг T2) имеется внутренний белок, связанный с нуклеиновой кислотой, который содержит полиамины (спермин, путресцин). Он обеспечивает суперспирализацию фаговой ДНК и ее упаковку в головке фага. Отросток (хвост) фага имеет полый белковый стержень (построен по типу спиральной симметрии), покрытый сократительным чехлом. Белки чехла связаны с молекулами АТФ и ионами кальция. Чехол способен сокращаться. Под чехлом в конце отростка может находиться лизоцим. Отросток обычно заканчивается базальной пластинкой, имеющей короткие зубцы, от которых отходят тонкие нити – структуры, обеспечивающие адсорбцию фага на бактерии.

Резистентность к факторам окружающей среды. Фаги более устойчивы к действую физических и химических факторов, чем бактерии и вирусы. Они выдерживают давление до 6 000 атм, сохраняют свою активность при рН от 2,5 до 8; не все дезинфицирующие вещества (0,5% раствор фенола, 1% раствора сулемы, этиловый спирт, эфир, хлороформ) разрушают фаги. Однако ультрафиолетовые лучи и ионизирующая радиация, 1% раствор формалина, температура 65-70 С инактивируют их. Они сохраняются длительное время при высушивании в запаянных ампулах, замораживании, в глицерине при температуре 185 С.

Антигенные свойства. Бактериофаги обладают иммуногенными свойствами, вызывают синтез антител (AT), которые не дают перекрестных реакций с антигенами (АГ) бактерий, инфицированных фагами. Для идентификации фагов применяют реакцию нейтрализации с гомологичной антисывороткой, реакцию преципитации, реакцию агглютинации. По антигенам фаги делятся на серотипы.

Взаимодействие фагов с бактерией включает несколько стадий.

Адсорбция фагов на бактерии осуществляется рецепторами фага, имеющимися на конце отростка, которые связываются с поверхностными структурами бактериальной стенки. Бактериофаги не адсорбируются на бактериях, лишенных клеточной

57

стенки (протопластах). Некоторые фаги адсорбируются на F-пилях бактерий. Адсорбция фагов зависит от рН среды, температуры, наличия некоторых веществ (триптофана для Т2-фага). На одной клетке может адсорбироваться до 300 фагов.

Внедрение нуклеиновой кислоты фага (инъекция фага). Базальная пластина отростка и его лизоцим лизируют участок клеточной стенки бактерии. Одновременно в чехле высвобождаются ионы кальция, активирующие АТФ-азу, происходит сокращение чехла и вталкивание стержня отростка через мембрану в бактерию. При этом фаговая ДНК (РНК) через стержень впрыскивается в цитоплазму клетки, белки головки и отростка остаются снаружи.

Репродукция фага. Проникнув в клетку ДНК фага переходит в латентное состояние (скрытая – эклипс-фаза). В этот период она подавляет синтетические клеточные процессы клетки и индуцирует синтез фаговых белков.

Синтез фаговых белков. Бактериальная РНК-полимераза транскрибирует фаговую ДНК в мРНК, по которой в рибосомах синтезируются ранние белки фага и его РНК-полимераза. Последняя обеспечивает транскрипцию поздних белков оболочки..

Репликацию фаговой нуклеиновой кислоты осуществляют синтезированные в клетке ДНК-полимеразы. ДНКбактерии нередко расщепляется и служит материалом для синтеза нуклеиновой кислоты фага.

Сборка фаговых частиц заключается в заполнении фаговой ДНК пустотелых капсид головки. Весь процесс осуществляется за 40 минут. Выход зрелых фагов обычно происходит путем лизиса бактериальной клетки. Лизис чаще всего осуществляется фаговым лизоцимом. Фаги, лизировавшие бактерии, называют вирулентными и они могут находиться в двух состояниях: 1) в виде зрелого фага – метаболически инертного, существующего вне клетки, и 2) вегетативного, который размножается в клетке и вызывает «продуктивную» инфекцию у бактерий. Некоторые ДНКсодержащие фаги (фаг fd) выходят из клетки путем «просачивания» ДНК через цитоплазматическую мембрану и клеточную стенку бактерии, где упаковываются в капсиды.

Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой характеризуются высокой специфичностью. Моновалентные фаги взаимодействуют только с бактериями определенного вида, а типовые фаги – только с отдельными вариантами (типами) данного вида бактерий. Типоспецифические бактериофаги используют для выявления соответствующих бактерий – т.е. для их фаготипирования. Поливалентные фаги могут взаимодействовать с родственными видами бактерий.

Умеренные фаги и лизогения. Взаимодействие фага с клеткой иногда ведет к интеграции его генома в геном бактерии. Фаги, вызывающие данный тип взаимодействия, называют умеренными. ДНК умеренного фага встраивается в ДНК бактерии и такой фаг называют профагом. Таким образом, умеренные фаги бывают в трех состояниях: зрелый фаг, вегетативный фаг и профаг. Профаг, ставший частью хромосомы бактерии, при ее размножении реплицируется синхронно с ее геномом, но не вызывает бактериолизиса, а передается по наследству от клетки к клетке неограниченному числу потомков.

58

Явление интеграции генома бактерии с умеренным фагом в состоянии профага называется лизогенией, а бактерии, несущие профаг – лизогенными. Бактериальная клетка, несущая в себе профаг, становится резистентной к действию идентичного фага. В клетке вырабатываются репрессоры – белки генома профага, препятствующие его размножению и проникновению в клетку идентичных фагов. Связь генома профага и бактерии непостоянна и под действием ультрафиолетовых лучей, радиации, некоторых химических веществ возможно образование зрелых форм фага и лизис бактерии. Эти фаги, бывшие профагами, могут со своей ДНК переносить группы генов бактерии в другую бактерию, в которой они снова переходят в профаг. Бактерия, зараженная таким фагом, приобретает новые свойства за счет генов предыдущей бактерии, перенесенных дефектным фагом. Изменение свойств микроорганизмов под влиянием профага обозначается как фаговая лизогенная конверсия. Она может происходить у многих видов микроорганизмов и сопровождается изменением их различных свойств: культуральных, биохимических, антигенных, токсигенных, чувствительности к антибиотикам. Причиной ее может быть наряду с переносом генов других бактерий с помощью фага, также активация молчащих генов бактерий, когда гены профага выступают в роли промоторов.

Явление переноса генов бактерий умеренными фагами называют трансдукцией. Эти фаги обычно неспособны образовывать фаговое потомство, если в их нуклеиновую кислоту встроилась часть нуклеиновой кислоты бактериальной клетки. Трансдуцирующие фаги используют в качестве векторов (переносчиков) в генной инженерии. С их помощью в бактерии переносят гены человеческих клеток, синтезирующие гормоны, цитокины и др.

Получение фагов. Для получения вирулентного фага готовят фильтрат исходного материала (вода, фильтрованная суспензия фекалий и др.), пропуская его через бактериальные фильтры.

Фильтрат вместе с соответствующей бактериальной культурой засевают в бульон и инкубируют при 370С в течение 18-24 часов. Фаги размножаются, и после лизиса культуры оставшиеся бактериальные клетки удаляют центрифугированием или фильтрацией через бактериальный фильтр.

Титрование бактериофагов проводят в жидкой (метод Аппельмана) или твердой (метод Грациа) питательной среде.

В пробирках с МПБ готовят десятикратные разведения бактериофага. В каждую пробирку вносят соответствующую бактериальную культуру по 0,1 мл. Через сутки инкубации в термостате при 370С оценивают результаты. Наибольшее разведение фага, в котором отсутствует рост бактерий, принимаются за титр фага.

По методу Грациа на чашки с МПА наносят смесь фагов и бактерий. Для этого к расплавленному и остуженному до 55 С агару добавляют деситикратные разведения бактериофага и соответствующую тест культуру. Смесь быстро выливают на поверхность МПА. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37 С. Незараженные фагом бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности агара.

Каждая инфицированная фагом бактерия лизируется и освобождает потомство фага, состоящие из сотен новых фаговых частиц. Они внедряются в интактные клетки

59

и весь цикл повторяется. В результате лизиса клеток фагом на сплошном бактериальном газоне появляются стерильные пятна. Число этих пятен соответствуют количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Титр фага – максимальное разведение фага, при котором еще отмечаются стерильные пятна лизиса.

Практическое использование фагов. Применение фагов основано на строгой специфичности их действия. Фаги используют в диагностике инфекционных болезней: проводят идентификацию выделенных культур микроорганизмов – фаготипирование, т.е. устанавливают с помощью фага принадлежность неизвестной выделенной культуры бактерии к определенному виду или типу. Фаготипирование имеет большое эпидемиологическое значение, так как позволяет установить источник и пути распространения инфекций; с помощью тест-культуры можно определить неизвестный фаг в исследуемом материале, что указывает на присутствие в нем соответствующих возбудителей.

Фаги применяют для лечения и профилактики инфекционных болезней. Налажено производство брюшнотифозного, сальмонеллезного, дизентерийного, протейного, синегнойного, стафилококкового, стрептококкового, коли-фагов и комбинированных фагов. Фаги выпускают в жидком виде, в таблетках с кислотоустойчивым покрытием, в форме мазей, аэрозолей, свечей.

Бактериофаги используют для изучения структуры генома бактерий и в генной инженерии в качестве вектора – переносчика генов человека в бактерии. В настоящее время получены культуры бактерий, синтезирующие интерферон, интерлейкины, гормоны человека.

60

V.ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

5.1.Особенности генетики микроорганизмов

Генетика – это наука о наследственности и наследуемой и ненаследуемой изменчивости.

В настоящее время генетика является подлинным фундаментом для молекулярной и клеточной биологии. В свою очередь, результаты исследований в области генетики микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов и простейших) оказались весьма важными для выяснения всех основных генетических закономерностей и принципов.

Это связано с тем, что изучение структуры и функции генетического материала, который может самовоспроизводиться, подвергаться изменениям и проявляться самыми разными способами, является чрезвычайно сложной задачей. Поэтому более простой по устройству организм является и наиболее удобной моделью для изучения этих процессов. Впоследствии было выявлено, что механизмы наследования признаков у высших организмов и бактерий имеют очень много общего. Бактерии и вирусы (в том числе вирусы бактерий – бактериофаги) оказались наиболее подходящими объектами для изучения природы генетического материала, его организации и функционирования.

Это было обусловлено следующими преимуществами работы с микроорганизмами:

1.Гаплоидное строение генома, т.е. у бактерий имеется лишь одна хромосомануклеоид, что позволяет оценить генетические изменения уже в первом поколении бактериальных клеток.

2.Высокая скорость размножения.

3.Относительно простое строение (особенно у вирусов).

4.Удобство культивирования с возможностью быстрого изменения внешних условий.

5.Высокая разрешающая способность генетического анализа микроорганизмов с обнаружением мутаций, возникающих с частотой 10-9 и менее.

6.Способность к комбинативной и мутационной изменчивости.

Наиболее интенсивно изучаемый вид в генетике микроорганизмов – это нормальный обитатель кишечника человека Escherchia coli. Данная бактерия легко культивируется в жидкой питательной среде, содержащей некоторые соли и простой источник углерода, например глюкозу. Из этих соединений Е.coli способна синтезировать все сложные органические молекулы, образующие клетку. За сутки культивирования популяция, возникшая из одной-единственной клетки Е.coli, может достигнуть 2-3*109 бактерий на 1 мл среды.

Полученную культуру засевают на чашку Петри с питательной средой. После инкубации бактерии начинают быстро делиться и дают на агаре колонии, которые являются потомками единственной микробной клетки. Отсюда можно получить чистую культуру любой мутантной бактерии, присутствовавшей в исходной бактериальной взвеси.

61