Файл: Новиков Д.К. Медицинская микробиология.pdf

наоборот). При транспозиции они могут вызывать делеции или инверсии генетического материала, а при включении в новый участок ДНК – дупликации.

По расположению мутации делятся на нуклеоидные и цитоплазменные (за счет плазмид).

По направлению выделяют прямые и обратные мутации Прямые – это изменения бактерий «дикого» типа. «Дикий» тип представляет со-

бой комплекс наследственных признаков клеток в естественных условиях обитания. Обратные мутации – это возврат от измененного типа к «дикому». Данный процесс может осуществляться и другим способом. Могут возникать мутации, подавляющие фенотипические проявления исходных (прямых) мутаций. Такие мутации называются

супрессорными или вторичными.

По фенотипическим последствиям выделяют нейтральные мутации – феноти-

пически не проявляются; условно-летальные и летальные.

Мутации, которые ведут к изменению (обычно – ограничению), но не к исчезновению функциональной активности фермента, называют условно-летальными. Некоторые температурочувствительные мутанты сохраняют способность к синтезу ферментов, активных при 370С, но не способных к катализу при при 420С. У бактерий же дикого типа эти ферменты функционируют при обеих температурах.

Летальные мутации ведут к полной потере способности синтезировать жизненно важный фермент или ферменты, что ведет к гибели бактериальной клетки.

Мутации проявляются в фенотипе в виде утраты или изменения морфологических и биохимических признаков (например, жгутиков, пилей, капсулы, клеточной стенки; способности ферментировать какие-либо углеводы, синтезировать определенные аминокислоты, витамины и другие соединения, возникновении устойчивости к лекарственным или дезинфицирующим веществам и т.д.)

Оценку мутаций на молекулярном уровне проводят путем определения последовательности ДНК соответствующих генов (секвенирования). На клеточном уровне мутации выявляют по фенотипическим изменениям – по утрате или приобретению конкретного белка или изменению его функции (ферментативной или регуляторной активности). Для оценки мутаций на уровне популяции определяют частоту появления мутаций и проводят последующую селекцию измененных клеток в популяции для дальнейшего изучения.

У бактерий в результате мутаций могут меняться самые различные свойства: вирулентность, чувствительность к антибиотикам, биохимические свойства. Мутанты, нуждающиеся для своего развития в определенных ростовых факторах (аминокислотах, азотистых основаниях и т.д.), называются ауксогетеротрофными. Они не имеют ферментов для их синтеза и сохраняют жизнеспособность лишь при наличии в среде соответствующих факторов роста.

5.7.2. Диссоциация

Диссоциация – это особый, присущий только бактериям вид изменчивости, при котором происходит расщепление в пределах одного вида на S- и R-формы микроорганизмов. Это явление впервые исследовали Э.Вейль и А.Феликс (1917 г.).

71

Воснову этого подразделения положены генетические перестройки, приводящие

кизменению ряда свойств (культуральных, антигенных, биохимических). Так, S- формы (англ. smooth – гладкий) чаще вирулентны, обладают хорошо выраженными антигенными свойствами, имеют капсулу, на средах дают рост мелких блестящих колоний. R-формы (англ. rough – грубый, неровный) реже вирулентны, не имеют капсулы, колонии крупные, шероховатые.

Однако не у всех микробов S-форма свидетельствует о вирулентности. Так сибиреязвенные культуры, возбудители туберкулеза и чумы вирулентны в R-форме.

Диссоциация обычно протекает в одном направлении: от S- к R-форме, иногда через промежуточные стадии образования слизистых колоний.

Причиной диссоциации могут быть мутации, возникающие после встраивания внехромосомных факторов наследственности (эписом и умеренных фагов) в нуклеоид. Мутации сопровождают и процессы встраивания в нуклеоид транспозонов и инсерционных последовательностей. Если эти мутации нарушают функцию оперонов, которые отвечают за образование липополисахаридов клеточной стенки микроба, то образуются R-формы. Они дают шероховатые колонии, меняют антигенные свойства и ослабляют патогенность. Тем не менее, у дифтерийных бактерий S-R-диссоциация связана с их лизогенизацией бактериофагом; при этом R-формы образуют токсин, и их вирулентность резко увеличивается.

Значение диссоциации заключается в получении бактериями селективных преимуществ, обеспечивающих их существование в организме человека или во внешней среде. Например, S-формы более устойчивы к фагоцитозу. R-формы, в свою очередь, более устойчивы к факторам окружающей среды.

5.7.3. Репарации

Большинство изменений генетического кода, возникающих в результате мутаций, ведут к нарушению структуры и функции бактериальных клеток и часто являются летальными. Лишь небольшое количество из них является приспособительными и закрепляется отбором. Отсюда в процессе эволюции неизбежно возникли мощные механизмы, приводящие к восстановлению структуры поврежденной ДНК. Такие системы получили название репарационных, а сам процесс восстановления – репарации.

Эти системы состоят из многочисленных ферментов, контролирующих состояние ДНК.

Типичным примером репарационных систем является система фотореактивации. Она активизируется при образовании тиминовых димеров в ДНК под действием ультрафиолетового облучения. Ферменты, ответственные за фотореактивацию (в частности – фотолиаза), действуют в присутствии видимого света и деполимеризуют тиминовые димеры до исходных мономеров.

Аналогичная система, функционирующая в отсутствие видимого света, называет-

ся системой темновой репарации.

Существует дорепликативная и пострепликативная репарация, которые отличаются по механизмам.

В случае дорепликативной репарации происходит выявление поврежденных участков и их эксцизия (вырезание) эндонуАклеазами с последующим удалением. Да-

72

лее осуществляется синтез поврежденной цепи по матрице сохранившейся и сшивание участков ДНК-лигазой.

Пострепликативная репарация обеспечивается рекомбинационными процессами с замещением поврежденных участков.

Особое место в жизнедеятельности как отдельных бактериальных клеток, так и всей микробной популяции в целом занимает так называемая SOS-репарация или SOS-ответ.

SOS-ответ представляет собой индуцируемую реакцию клеток на резкую остановку синтеза нуклеиновых кислот, вызванную обширным повреждением ДНК, голоданием клетки или другими факторами. Это крайний ответ клетки на критическое состояние, приближающее ее к гибели. У Е. соli результатом SOS-ответа является индукция синтеза около 25 белков, имеющих прямое отношение к репарации, рекомбинации и синтезу ДНК.

Этот вид репарации у микробов контролируется так называемой SOS-областью (или SOS-регулоном). В норме эта область находится в репрессированном состоянии и активируется лишь в критические для клетки моменты. Возникает взрыв генетических процессов – возрастает частота мутаций как точечных, так и по типу сдвига рамки считывания, увеличивается частота хромосомных перестроек, активируются специализированные системы делеции ДНК, возрастает частота рекомбинационных обменов, и наконец, становится возможной запрещенная межвидовая рекомбинация.

Задача SOS-индуцированного мутагенеза – заставить ДНК-полимеразу пройти повреждение даже ценой ошибки.

SOS-ответ имеет весьма важное значение для развития микробной популяции в целом. К настоящему времени уже выяснено, что и эволюция генома, и шоковая адаптация популяции к изменившимся внешним условиям происходит не только путем постепенного накопления необходимого числа мутаций для получения нового признака. Лишь горизонтальный (в том числе – межвидовой) перенос блоков, составляющих гены, или даже целых генов, может обеспечить моментальное приобретение нужного качества.

В природной популяции Е. соli до 1% клеток имеют мутантный фенотип. Таково условие выживания данной популяции. В благоприятных же искусственных условиях число клеток-мутантов снижается на несколько порядков. Отсюда для постоянно идущего процесса эволюционной изменчивости более выгодны стрессовые ситуации, предусматривающие, в частности, межвидовой обмен генетическим материалом. Это и обеспечивает индуцибельная система SOS.

5.8. Рекомбинационная (комбинативная) изменчивость

Рекомбинация у бактерий – перенос генетического материала от клетки-донора к клетке-реципиенту или от одного репликона к другому. Она является важнейшим фактором эволюции. В результате происходит обмен генетической информацией между отдельными особями. Рекомбинации могут наблюдаться на уровне любых живых организмов – от прокариотов до высших эукариотов.

73

Прокариоты не обладают половым типом размножения. При попадании к реципиенту части ДНК донора образуется неполная зигота – мерозигота. В этом случае образуется только один рекомбинант, основу генома которого представляет геном реципиента с включенным фрагментом ДНК донора.

Выделяют следующие основные типы рекомбинаций:

Общая рекомбинация. Она происходит между гомологичными последовательностями ДНК.

Сайт-специфическая рекомбинация. Это рекомбинация по небольшой комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты.

Незаконная рекомбинация. Этот вид рекомбинации происходит между последовательностями ДНК, не имеющими структурного сходства.

Основные процессы, обеспечивающие обмен генетической информацией, можно проследить на примере общей рекомбинации.

Выявлено, что есть особые группы генов, участвующих в рекомбинациях: rесА, recВ, reсС, recD. Они кодируют в нормальных клетках образование специфических ферментов-рекомбиназ (RecA, RecBCD).

RecА – полифункциональный белок, который синтезируется в неактивной форме. Он активируется при связывании с ДНК. RecА действует как ДНК-хеликаза (расплетает двухцепочечную ДНК), а также обладает протеолитической активностью – расщепляет ряд репрессоров – например, снимает репрессию с профага в нуклеоиде. Белок RесА катализирует переориентацию цепей ДНК с образованием структуры Холлидея (см. ниже).

Мутации в гене recА могут уменьшать частоту рекомбинации более чем в 1000

раз.

RecBCD-нуклеаза кодируется тремя генами – гесВ, гесС и гесD. Используя энергию АТФ RecBCD-нуклеаза временно деспирализует двойную цепь (дуплекс) дезоксирибонуклеиновой кислоты (проявляет хеликазную активность). При этом образуется фрагмент одноцепочечной ДНК, где затем связывается RесА. Кроме того, она специфически разрезает структуру Холлидея для завершения рекомбинации.

Рекомбинация начинается в результате обмена одноцепочечными участками между родительскими двухцепочечными дуплексными молекулами ДНК. Это обусловлено взаимодействием гомологичных (комплементарных) участков ДНК в родительских молекулах. Соединенные родительские молекулы ДНК образуют структуру креста («крест Р. Холлидея»). После образования такой структуры центр ее может перемещаться вдоль цепей ДНК как застежка-«молния». При этом размыкаются водородные связи между комплементарными цепями внутри родительской молекулы ДНК и замыкаются связи между цепями из различных родительских молекул ДНК. Образуется так называемый гетеродуплексный участок в обеих родительских молекулах ДНК. Вращение структуры Холлидея вокруг точки перекреста приводит к образованию различных рекомбинантных молекул ДНК.

У бактерий существует 3 основных способа, которые приводят к образованию рекомбинантных молекул – трансформация, трансдукция и конъюгация.

5.8.1. Трансформация

74

Трансформация – это перенос генетической информации из донорской клетки в реципиентную при помощи искусственно выделенной или высвободившейся при лизисе клетки естественным путем ДНК.

Путем трансформации в реципиентную клетку можно передать следующие свойства: капсулообразование, устойчивость к антибиотикам, устойчивость к сульфаниламидным препаратам, способность синтезировать различные аминокислоты и др.

Наибольшей трансформирующей активностью обладает нативная ДНК. Трансформирующая роль ДНК была установлена в опытах О.Эвери, К.Мак-Леод и М.МакКарти в 1944 г. в пробирках с использованием очищенной ДНК, полученной из капсульных клеток пневмококков IIIS типа.

Началом в изучении трансформации послужили опыты Ф.Гриффитса с культурами пневмококка. Пневмококки способны к диссоциации, образуя капсульные S- формы и бескапсульные R-формы. Когда пневмококки в R-форме попадают в организм животного, например мыши, то животное переносит заражение вследствие поглощения бактериальных клеток фагоцитами. Однако мышь, зараженная бактериями S-типа, неизбежно погибает из-за наличия капсулы, препятствующей фагоцитозу. В 1928 г. Фредерик Гриффитс показал, что если мыши ввести пневмококки типа IIR вместе с убитыми нагреванием бактериями типа IIIS, то мыши погибают от инфекции. Исследование выделенных от погибших животных культур показало, что они принадлежат к типу IIIS. Контрольные эксперименты продемонстрировали, что по отдельности ни введение живых R-форм, ни инъекция убитых нагреванием пневмококков IIIS не приводит к гибели мышей. Гриффитс заключил, что непатогенные клетки штамма IIR могут трансформироваться в патогенные убитыми нагреванием пневмококками штамма IIIS. Далее было обнаружено, что трансформация непатогенных штаммов пневмококка в патогенные может осуществляться и в лабораторной культуре клеток.

Было высказано предложение, что трансформирующим агентом, передающим способность вырабатывать капсулы, является полисахаридная субстанция капсул. Позднее в бесклеточных структурах – в экстрактах капсульных бактерий – был выявлен фактор трансформации. Он оказался чувствительным к нагреванию (80оС) и осаждался спиртом.

Эвери, Мак-Леод и Мак-Карти доказали, что трансформирующий фактор устойчив к РНКазе, действию протеолитических ферментов, но чувствителен к ДНКазе, обладает высокой молекулярной массой. Отсюда они пришли к выводу, что этот фактор

– ДНК.

Трансформация проходит в несколько этапов.

Первоначально происходит адсорбция ДНК на поверхности реципиентной клетки. Чаще всего с донорской ДНК в реципиентную клетку передается только один ген. Это связано с невозможностью передачи при трансформации протяженного фрагмента ДНК (обычно он не превышает 1/100 длины нуклеоида), т. е. включает один ген или одну группу сцепления. Чем выше гомологичность цепей ДНК донора и реципиента, тем эффективнее гибридизация.

Затем следует энергозависимая стадия – донорская ДНК проникает в реципиентную клетку, причем реципиентная клетка должна быть жизнеспособной с активным обменом веществ, должна находиться в стадии «компетентности», т.е. в ней появля-

75