ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 01.12.2019
Просмотров: 3465
Скачиваний: 3
Рис. 30. Структура NO-синтазы [Горрен, Майер, 1998]
/ - редуктазный домен; 2 - оксигеназный домен; Apr - остаток аргинина; КМ - кальмодулин; ФАД и ФМН - флавиновые нуклеотиды; ВН4 - птеридин; Fe - гем
передаче элиситорного сигнала от рецепторов к NO-син-тазам.
NO-синтаза у растений была обнаружена практически одновременно в нескольких лабораториях [Cueto et al., 1996; Leshem, 1996; Ninnemann, Maier, 1996; Noritake et al., 1996]. Для нас особый интерес представляют исследования, в которых была показана роль N0 в абиотических и биотических стрессах [Leshem, Haramathy, 1996; Haramathy, Leshem, 1997; Huang, Knopp, 1998]. Оказалось, что активация NO-синтазы происходит у устойчивых к патогенам растений [Delledone et al., 1998; Klessig et al., 2000], а образующийся NO вызывает синтез фитоалексинов и защитных белков [Noritake et al., 1996; Dangl, 1998; Delledone et al., 1998]. Вызванное патогенами и элиситорами многократное повышение содержания NO в тканях растений стали называть "NO-взрывом", по аналогии с "окислительным взрывом" [Foissneretal., 2000].
С 1998 г. начинается интенсивный поиск сходства и различий в функционировании NO-сигнальных систем у животных и растений. Было найдено, что, так же как у животных, в качестве сигнальных посредников между NO и геномом выступают цГМФ- и цАДФ-рибоза (см. рис. 29)
Рис. 31. Структура диме-ра цитоплазматической гуанилатциклазы, состоящей из al- и (31-субъединиц [Denninger, Marietta, 1999] Fe2+ - гем
[Delledone et al., 1998; Durner et al., 1998; Hausladen, Stamler, 1998], что растительная NO-синтаза инги-бируется теми же соединениями, что и животная.
цГМФ образуется из ГТФ с помощью растворимой цитоплазматической гетеродимерной гуанилатциклазы. Одна из субъединиц фермента содержит гем, связанный с остатком гистидина (рис. 31). Активация гуанилатциклазы происходит при взаимодействии NO с гемом [Denninger, Marietta, 1999]. Необходимо отметить, что NO-индуцируемое накоп-
Бремя воздействия NO, ч
Рис. 32. Влияние NO на образование цГМФ в суспензии клеток табака [Durner et al., 1998]
I - клетки, обработанные донором NO; 2 - контроль. Стрелкой показано начало воздействия NO
ление цГМФ имеет преходящий характер (рис. 32). Участие цГМФ в сигнальной сети клеток определяется его способностью активировать некоторые протеинкиназы, открывать катионные каналы и регулировать активность фосфо-диэстераз.
В отличие от животных, в NO-синтазной системе растений принимает участие салициловая кислота в качестве посредника между N0 и геномом [Durner et al., 1998; Hausladen, Stamler, 1998; McDowell, Dangl, 2000; Kumar, Klessig, 2000]. Изучение с помощью иммуноблотинга синтеза некоторых белков, индуцируемых различными интермедиатами NO-синтазной системы, в сочетании с использованием ингибиторов гуанилатциклазы и трансгенных растений с привнесенным бактериальным геном салицилат-гидроксилазы позволил прийти к выводу о разветвленной структуре этого сигнального пути. О первой точке ветвления можно судить по открытию цГМФ-зависимой и независимой NO-индук-ции фенилаланин-аммиак-лиазы, о второй - по NO-индуци-рованному салицилатзависимому образованию матричных РНК белка PR-1 и NO-индуцированному салицилатнезави-симому образованию фенилаланин-аммик-лиазы [Durner et al., 1998]. Многократное накопление салицилата под влиянием NO было показано во многих работах, и в связи с этим были оправданы исследования взаимосвязей NO и салицилата при функционировании NO-синтазной сигнальной системы. Существование NO-индуцированного цАДФрибоза-зависимого- и цАДФрибозанезависимого синтеза белков (PR-1) [Klessig et al., 2000] предполагает еще одну точку ветвления NO-сигнального пути. Обслуживает NO-синтаз-ную систему, помимо NO-синтазы, еще целый ряд ферментов, активируемых различными интермедиатами этого сигнального пути [Klessig et al., 2000]. Монооксид азота активирует гуанилатциклазу, катализирующую образование цГМФ, который, в свою очередь, активирует цГМФ-зависи-мую протеинкиназу, а последняя - факторы регуляции транскрипции (NO -> цГМФ -> ПК -> ФРТ -> геном) и кальциевые каналы (NO —> цГМФ —» активация кальциевых каналов —> повышение концентрации ионов кальция в цитозо-ле —> Са-зависимые ПК —> ФРТ -> геном). Салициловая кислота, накапливающаяся в результате гидролиза глюкозил-салицилата или активации ФАЛ, способна активировать
специальную изоформу МАР-киназы (СК —> салицилатин-дуцируемая МАР-киназа -» ФРТ -> геном). Циклический гуанозинмонофосфат способен активировать АДФ-рибо-зил-циклазу, катализирующую образование цАДФрибозы, а последняя открывает кальциевые каналы (цГМФ —» цАДФрибоза —> повышение содержания Са2+ в цитозоле -» Са-зависимые ПК —> ФРТ —> геном).
NO является весьма активным свободным радикалом (время его жизни in vivo составляет, по-видимому, немногим более 10 с), он способен взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами и белками неферментативно (рис. 33). Так, было обнаружено, что у животных NO изменяет активность железорегуляторного белка цитоплазмы (ЖРБ), который связывает специфический элемент матричных РНК и поэтому активирует или ингибирует их [Klausner et al., 1997]. Оказалось, что у растений NO оказывал влияние на изоформу ЖРБ - аконитазу, вызывая ее ингибирова-ние, что косвенно свидетельствует (наряду с существованием протяженных консервативных последовательностей у этих ферментов) о возможности влияния NO на процессы трансляции непосредственно, неферментативно, минуя классические и относительно долгие ферментативные сигнальные пути. По-видимому, NO может влиять и на процессы транскрипции, если учитывать факт ингибирования им ДНК-связывающей активности факторов регуляции транскрипции при S-нитрозилировании определенного ци-стеинового остатка. Кроме того, обнаружено, что экзогенный NO активировал ДНК-метилтрансферазу, что приводило к повышению содержания метилированных остатков цитозина в ДНК и, вследствие этого, препятствовало связыванию факторов регуляции транскрипции с промотор-ными участками генов и переводу их из активных в "молчащие" [Bogdan, 2001].
Еще один возможный неферментативный путь - нитро-зилирование монооксидом азота S-белков кальциевых каналов, что приводит к их открыванию и повышает концентрацию ионов кальция в цитозоле [Klausner et al., 1997]. Так же как и в случае белков кальциевых каналов, нитрозили-рование цитозольных S-белков может привести к изменению их конформации, а это, в свою очередь, - к атакуемо-сти протеазами и изменению времени жизни S-белков.
Рис. 33. Схема NO-синтазной сигнальной системы, дополненная неферментативным влиянием NO на метаболические процессы
ЖРБ - железорегуляторный белок; ПК - протеинкиназа; СИПК -салицилатиндуцируемая протеинкиназа; ФАЛ - фенилаланин-аммиак-лиаза; ФРТ - факторы регуляции транскрипции
N0 и образующийся из него пероксинитрит могут окислять тиоловые остатки в белках с образованием сульфено-вых R-SOH-, сульфиновых R-SO2H- и сульфоновых R-SO3H-остатков [Bogdan, 2001]. В результате окисления тиоловых остатков сульфгидрильные группы могут окисляться до ди-сульфидных. Обнаружено, что под влиянием NO происходит разрушение кластеров ZnS в "цинковых пальцах" факторов регуляции транскрипции, и это приводит к повышению концентрации ионов цинка в цитозоле и ядре.
Неферментативными путями вмешательства N0 в белковый метаболизм тканей растений могут быть объяснены данные о влиянии донора NO - нитропруссида, на набор белков, полученные в нашей лаборатории В.Г. Яковлевой. Введение в проростки гороха нитропруссида привело уже через сутки после начала опыта к изменению набора полипептидов в растениях. Исчезли характерные для контрольных растений полипептиды 19 и 30 кДа и появились новые с молекулярными массами 32 и 36 кДа.
Проростки гороха уже давно стали для нашей лаборатории модельным объектом, с помощью которого мы исследовали влияние на набор и содержание белков салициловой [Тарчевский и др., 1996а, б; 1999; 2001], янтарной |Тарчевский и др., 1999], абсцизовой [Тарчевский и др., 2001], жасмоновой [Тарчевский и др., 1996а, б] кислот, а также инфицирования микоплазмами [Тарчевский и др., 1996а, б]. Во всех случаях наблюдаемое изменение набора полипептидов в растениях отмечалось лишь через несколько дней после начала воздействия того или иного исследуемого соединения. Через сутки после начала воздействия на проростки гороха салициловой кислоты не произошло изменения набора полипептидов, наблюдалось лишь некоторое относительное (по сравнению с контрольными растениями) повышение содержания полипептида 34 кДа, Быстрое салицилатнезависимое появление этого полипептида, вызванное донором NO нитропруссидом, могло объясняться неферментативной активацией матричной РНК с помощью монооксида азота.
Ранее [Durner et al., 1998; Klessig et a!., 2000] было установлено, что NO вызывал достаточно быстрое появление двух белков - PR 1 и фенилаланин-аммиак-лиазы - менее чем через 24 ч после начала воздействия, но эти результаты
были получены в опытах с использованием более чувствительного метода иммуноблотинга.
Быстрое NO-индуцированное салицилатнезависимое исчезновение полипептидов 19 и 30 кДа в опытах, проведенных в нашей лаборатории, можно было бы объяснить прекращением их синтеза. Но это происходило бы лишь в том случае, если скорость их оборота была бы очень велика. Возможно, что непосредственное взаимодействие NO с этими белками приводило к изменению их конформации и, вследствие этого, к быстрой деградации с помощью протеаз.
Примечателен тот факт, что многократное повышение (всплеск) содержания цГМФ, вызванное N0, было преходящим [Dinner et al., 1998], но синтез NO-индуцированных белков продолжался, что свидетельствует о гораздо большем времени жизни более поздних звеньев этого сигнального пути.
Остается неясным, что в NO-синтазой системе является рецептором элиситоров, расположены они в плазмалемме или цитозоле и принимают ли участие G-белки в качестве промежуточного звена между рецептором и NO-синтазой? Ответа на этот вопрос не содержится ни в статьях журнала "Биохимия" [1998. Т. 63, вып. 7], специально посвященного N0, ни в пока еще немногочисленных статьях о сигнальной функции NO у растений. Возникает вопрос: не является ли рецептором сама молекула фермента NO-синтазы? К этому предположению склоняют ее сложность и присутствие в доменах регуляторных цистеиновых сайтов, изменение активности в ответ на различные эффекторы, такие как цитоки-ны у животных, на фосфорилирование, существование небольшого эндогенного белкового ингибитора, препятствующего образованию активной димерной формы фермента. Интересно, что мутантные мыши, лишенные каждая одной из изоформ NO-синтазы, оказались жизнеспособными, но обнаруживали ряд особенностей в поведении. Кроме того, мыши, дефектные по индуцибельной NO-синтазе, были более чувствительны к инфекциям [Snyder, 1995].
Интенсивные исследования функционирования NO-син-тазной сигнальной системы у растений должны в ближайшем будущем привести к новым интересным фактам, касающимся локализации ферментов этой системы, регуляции их активности, взаимоотношений с другими сигнальными системами и т.д.
ПРОТОННАЯ СИГНАЛЬНАЯ СИСТЕМА
При анализе участия различных сигнальных систем в защитных реакциях против патогенов (образование фитоале-ксинов и т.д.) необходимо учитывать, что одна из наиболее ранних и неопровержимо доказанных реакций клеток на действие элиситоров, учитываемых с помощью селективных электродов или флуоресцирующих рН-индикаторных красок, - быстрое преходящее изменение в цитозоле концентрации протонов за счет входа Н+ из вакуоли и внеклеточной среды [Conrath et al., 1991; Mathieu et al., 1991; 1994; 1996; Horn et al., 1992; Nurnberger et al., 1994; Hahlbrock et al., 1995; Amano et al., 1997; Jabs et al., 1997; Roos et al., 1998]. Трансмембранное передвижение протонов происходит по градиенту концентрации за счет того, что с внешней стороны плазмалеммы среда более кислая, чем с внутренней, и разница может достигать двух единиц рН.