Файл: tarchevskiy_i_a_signal_nye_sistemy_kletok_rasteniy.doc

ВУЗ: Не указан

Категория: Не указан

Дисциплина: Не указана

Добавлен: 01.12.2019

Просмотров: 3465

Скачиваний: 3

ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.

Рис. 30. Структура NO-синтазы [Горрен, Майер, 1998]

/ - редуктазный домен; 2 - оксигеназный домен; Apr - остаток ар­гинина; КМ - кальмодулин; ФАД и ФМН - флавиновые нуклеотиды; ВН4 - птеридин; Fe - гем

передаче элиситорного сигнала от рецепторов к NO-син-тазам.

NO-синтаза у растений была обнаружена практически одновременно в нескольких лабораториях [Cueto et al., 1996; Leshem, 1996; Ninnemann, Maier, 1996; Noritake et al., 1996]. Для нас особый интерес представляют исследования, в ко­торых была показана роль N0 в абиотических и биотиче­ских стрессах [Leshem, Haramathy, 1996; Haramathy, Leshem, 1997; Huang, Knopp, 1998]. Оказалось, что активация NO-синтазы происходит у устойчивых к патогенам растений [Delledone et al., 1998; Klessig et al., 2000], а образующийся NO вызывает синтез фитоалексинов и защитных белков [Noritake et al., 1996; Dangl, 1998; Delledone et al., 1998]. Выз­ванное патогенами и элиситорами многократное повыше­ние содержания NO в тканях растений стали называть "NO-взрывом", по аналогии с "окислительным взрывом" [Foissneretal., 2000].

С 1998 г. начинается интенсивный поиск сходства и различий в функционировании NO-сигнальных систем у животных и растений. Было найдено, что, так же как у животных, в качестве сигнальных посредников между NO и геномом выступают цГМФ- и цАДФ-рибоза (см. рис. 29)


Рис. 31. Структура диме-ра цитоплазматической гуанилатциклазы, со­стоящей из al- и (31-субъединиц [Denninger, Marietta, 1999] Fe2+ - гем

[Delledone et al., 1998; Durner et al., 1998; Hausladen, Stamler, 1998], что раститель­ная NO-синтаза инги-бируется теми же со­единениями, что и животная.

цГМФ образуется из ГТФ с помощью растворимой цито­плазматической гетеродимерной гуанилатциклазы. Одна из субъединиц фермента содержит гем, связанный с остатком гистидина (рис. 31). Активация гуанилатциклазы происхо­дит при взаимодействии NO с гемом [Denninger, Marietta, 1999]. Необходимо отметить, что NO-индуцируемое накоп-

Бремя воздействия NO, ч

Рис. 32. Влияние NO на образование цГМФ в суспензии клеток табака [Durner et al., 1998]

I - клетки, обработанные донором NO; 2 - контроль. Стрелкой по­казано начало воздействия NO


ление цГМФ имеет преходящий характер (рис. 32). Участие цГМФ в сигнальной сети клеток определяется его способ­ностью активировать некоторые протеинкиназы, откры­вать катионные каналы и регулировать активность фосфо-диэстераз.

В отличие от животных, в NO-синтазной системе расте­ний принимает участие салициловая кислота в качестве по­средника между N0 и геномом [Durner et al., 1998; Hausladen, Stamler, 1998; McDowell, Dangl, 2000; Kumar, Klessig, 2000]. Изучение с помощью иммуноблотинга синтеза некоторых белков, индуцируемых различными интермедиатами NO-синтазной системы, в сочетании с использованием ингиби­торов гуанилатциклазы и трансгенных растений с привне­сенным бактериальным геном салицилат-гидроксилазы по­зволил прийти к выводу о разветвленной структуре этого сигнального пути. О первой точке ветвления можно судить по открытию цГМФ-зависимой и независимой NO-индук-ции фенилаланин-аммиак-лиазы, о второй - по NO-индуци-рованному салицилатзависимому образованию матричных РНК белка PR-1 и NO-индуцированному салицилатнезави-симому образованию фенилаланин-аммик-лиазы [Durner et al., 1998]. Многократное накопление салицилата под влия­нием NO было показано во многих работах, и в связи с этим были оправданы исследования взаимосвязей NO и салици­лата при функционировании NO-синтазной сигнальной сис­темы. Существование NO-индуцированного цАДФрибоза-зависимого- и цАДФрибозанезависимого синтеза белков (PR-1) [Klessig et al., 2000] предполагает еще одну точку ветвления NO-сигнального пути. Обслуживает NO-синтаз-ную систему, помимо NO-синтазы, еще целый ряд фермен­тов, активируемых различными интермедиатами этого сиг­нального пути [Klessig et al., 2000]. Монооксид азота активи­рует гуанилатциклазу, катализирующую образование цГМФ, который, в свою очередь, активирует цГМФ-зависи-мую протеинкиназу, а последняя - факторы регуляции транскрипции (NO -> цГМФ -> ПК -> ФРТ -> геном) и каль­циевые каналы (NO —> цГМФ —» активация кальциевых ка­налов —> повышение концентрации ионов кальция в цитозо-ле —> Са-зависимые ПК —> ФРТ -> геном). Салициловая кис­лота, накапливающаяся в результате гидролиза глюкозил-салицилата или активации ФАЛ, способна активировать

специальную изоформу МАР-киназы (СК —> салицилатин-дуцируемая МАР-киназа -» ФРТ -> геном). Циклический гуанозинмонофосфат способен активировать АДФ-рибо-зил-циклазу, катализирующую образование цАДФрибозы, а последняя открывает кальциевые каналы (цГМФ —» цАДФрибоза —> повышение содержания Са2+ в цитозоле -» Са-зависимые ПК —> ФРТ —> геном).

NO является весьма активным свободным радикалом (время его жизни in vivo составляет, по-видимому, немно­гим более 10 с), он способен взаимодействовать с нуклеи­новыми кислотами и белками неферментативно (рис. 33). Так, было обнаружено, что у животных NO изменяет ак­тивность железорегуляторного белка цитоплазмы (ЖРБ), который связывает специфический элемент матричных РНК и поэтому активирует или ингибирует их [Klausner et al., 1997]. Оказалось, что у растений NO оказывал влияние на изоформу ЖРБ - аконитазу, вызывая ее ингибирова-ние, что косвенно свидетельствует (наряду с существова­нием протяженных консервативных последовательностей у этих ферментов) о возможности влияния NO на процес­сы трансляции непосредственно, неферментативно, минуя классические и относительно долгие ферментативные сиг­нальные пути. По-видимому, NO может влиять и на про­цессы транскрипции, если учитывать факт ингибирования им ДНК-связывающей активности факторов регуляции транскрипции при S-нитрозилировании определенного ци-стеинового остатка. Кроме того, обнаружено, что экзоген­ный NO активировал ДНК-метилтрансферазу, что приво­дило к повышению содержания метилированных остатков цитозина в ДНК и, вследствие этого, препятствовало свя­зыванию факторов регуляции транскрипции с промотор-ными участками генов и переводу их из активных в "мол­чащие" [Bogdan, 2001].


Еще один возможный неферментативный путь - нитро-зилирование монооксидом азота S-белков кальциевых ка­налов, что приводит к их открыванию и повышает концен­трацию ионов кальция в цитозоле [Klausner et al., 1997]. Так же как и в случае белков кальциевых каналов, нитрозили-рование цитозольных S-белков может привести к измене­нию их конформации, а это, в свою очередь, - к атакуемо-сти протеазами и изменению времени жизни S-белков.


Рис. 33. Схема NO-синтазной сигнальной системы, дополнен­ная неферментативным влиянием NO на метаболические про­цессы

ЖРБ - железорегуляторный белок; ПК - протеинкиназа; СИПК -салицилатиндуцируемая протеинкиназа; ФАЛ - фенилаланин-аммиак-лиаза; ФРТ - факторы регуляции транскрипции

N0 и образующийся из него пероксинитрит могут окис­лять тиоловые остатки в белках с образованием сульфено-вых R-SOH-, сульфиновых R-SO2H- и сульфоновых R-SO3H-остатков [Bogdan, 2001]. В результате окисления тиоловых остатков сульфгидрильные группы могут окисляться до ди-сульфидных. Обнаружено, что под влиянием NO происхо­дит разрушение кластеров ZnS в "цинковых пальцах" фак­торов регуляции транскрипции, и это приводит к повыше­нию концентрации ионов цинка в цитозоле и ядре.

Неферментативными путями вмешательства N0 в бел­ковый метаболизм тканей растений могут быть объяснены данные о влиянии донора NO - нитропруссида, на набор белков, полученные в нашей лаборатории В.Г. Яковлевой. Введение в проростки гороха нитропруссида привело уже через сутки после начала опыта к изменению набора поли­пептидов в растениях. Исчезли характерные для контроль­ных растений полипептиды 19 и 30 кДа и появились новые с молекулярными массами 32 и 36 кДа.

Проростки гороха уже давно стали для нашей лабора­тории модельным объектом, с помощью которого мы ис­следовали влияние на набор и содержание белков салици­ловой [Тарчевский и др., 1996а, б; 1999; 2001], янтарной |Тарчевский и др., 1999], абсцизовой [Тарчевский и др., 2001], жасмоновой [Тарчевский и др., 1996а, б] кислот, а также инфицирования микоплазмами [Тарчевский и др., 1996а, б]. Во всех случаях наблюдаемое изменение набора полипептидов в растениях отмечалось лишь через несколь­ко дней после начала воздействия того или иного исследуе­мого соединения. Через сутки после начала воздействия на проростки гороха салициловой кислоты не произошло из­менения набора полипептидов, наблюдалось лишь некото­рое относительное (по сравнению с контрольными расте­ниями) повышение содержания полипептида 34 кДа, Бы­строе салицилатнезависимое появление этого полипепти­да, вызванное донором NO нитропруссидом, могло объяс­няться неферментативной активацией матричной РНК с помощью монооксида азота.

Ранее [Durner et al., 1998; Klessig et a!., 2000] было уста­новлено, что NO вызывал достаточно быстрое появление двух белков - PR 1 и фенилаланин-аммиак-лиазы - менее чем через 24 ч после начала воздействия, но эти результаты


были получены в опытах с использованием более чувстви­тельного метода иммуноблотинга.

Быстрое NO-индуцированное салицилатнезависимое ис­чезновение полипептидов 19 и 30 кДа в опытах, проведенных в нашей лаборатории, можно было бы объяснить прекраще­нием их синтеза. Но это происходило бы лишь в том случае, если скорость их оборота была бы очень велика. Возможно, что непосредственное взаимодействие NO с этими белками приводило к изменению их конформации и, вследствие это­го, к быстрой деградации с помощью протеаз.

Примечателен тот факт, что многократное повышение (всплеск) содержания цГМФ, вызванное N0, было преходя­щим [Dinner et al., 1998], но синтез NO-индуцированных белков продолжался, что свидетельствует о гораздо большем време­ни жизни более поздних звеньев этого сигнального пути.

Остается неясным, что в NO-синтазой системе является рецептором элиситоров, расположены они в плазмалемме или цитозоле и принимают ли участие G-белки в качестве промежуточного звена между рецептором и NO-синтазой? Ответа на этот вопрос не содержится ни в статьях журнала "Биохимия" [1998. Т. 63, вып. 7], специально посвященного N0, ни в пока еще немногочисленных статьях о сигнальной функции NO у растений. Возникает вопрос: не является ли рецептором сама молекула фермента NO-синтазы? К этому предположению склоняют ее сложность и присутствие в до­менах регуляторных цистеиновых сайтов, изменение актив­ности в ответ на различные эффекторы, такие как цитоки-ны у животных, на фосфорилирование, существование не­большого эндогенного белкового ингибитора, препятству­ющего образованию активной димерной формы фермента. Интересно, что мутантные мыши, лишенные каждая одной из изоформ NO-синтазы, оказались жизнеспособными, но обнаруживали ряд особенностей в поведении. Кроме того, мыши, дефектные по индуцибельной NO-синтазе, были бо­лее чувствительны к инфекциям [Snyder, 1995].

Интенсивные исследования функционирования NO-син-тазной сигнальной системы у растений должны в ближай­шем будущем привести к новым интересным фактам, каса­ющимся локализации ферментов этой системы, регуляции их активности, взаимоотношений с другими сигнальными системами и т.д.

ПРОТОННАЯ СИГНАЛЬНАЯ СИСТЕМА

При анализе участия различных сигнальных систем в за­щитных реакциях против патогенов (образование фитоале-ксинов и т.д.) необходимо учитывать, что одна из наиболее ранних и неопровержимо доказанных реакций клеток на действие элиситоров, учитываемых с помощью селектив­ных электродов или флуоресцирующих рН-индикаторных красок, - быстрое преходящее изменение в цитозоле кон­центрации протонов за счет входа Н+ из вакуоли и внекле­точной среды [Conrath et al., 1991; Mathieu et al., 1991; 1994; 1996; Horn et al., 1992; Nurnberger et al., 1994; Hahlbrock et al., 1995; Amano et al., 1997; Jabs et al., 1997; Roos et al., 1998]. Трансмембранное передвижение протонов происходит по градиенту концентрации за счет того, что с внешней сторо­ны плазмалеммы среда более кислая, чем с внутренней, и разница может достигать двух единиц рН.