ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 01.12.2019
Просмотров: 3414
Скачиваний: 3
Так, в культуре клеток табака происходили подкисление цитозоля и подщелачивание инкубационной среды, вызванное олигогалактуронидами [Mathieu et al., 1991]. Подкисление цитозоля и подщелачивание среды наблюдались в суспензионных клетках табака не только при действии олиго-галактуронидов, но и криптогеина и других элиситоров [Mathieu et al., 1996], причем интенсивность и кинетика сдвига рН зависела от вида элиситоров, связывающихся с рецепторами плазмалеммы. Механизм преобразования элиситор-ных сигналов, приводящий к открыванию протонных каналов, продолжает оставаться невыясненным. Совершенно очевидно, что необходимым звеном этого механизма является фосфорилирование белков Н+-каналов [Mathieu et al., 1996]. Показано, что ингибиторы протеинкиназ, например стауроспорин, подавляли элиситориндуцируемое подкисление цитозоля, а ингибитор протеинфосфатаз каликулин А
вызывал снижение рН в цитозоле и повышение рН в суспензионной среде даже в отсутствие элиситора. Это свидетельствует об участии процессов фосфорилирования-де-фосфорилирования в элиситации изменений рН и заставляет с большим вниманием отнестись к представлениям о сигнальной роли трансмембранного изменения концентрации протонов [Скулачев, 1989; Polevoi et al., 1996], тем более что оно приводило к синтезу классических патогениндуцируе-мых белков. Примером может служить искусственное подкисление цитозоля, которое вызывало образование фенил-ал анин-аммиак-лиазы [Mathieu et al., 1994]. Продолжают оставаться невыясненными интермедиаты протонной сигнальной системы. Обнаружение протонозависимой активации некоторых изоформ МАР-киназ [Тепа, Renaudin, 1998] позволяет выстроить ранее скрытую последовательность звеньев протонной сигнальной системы: сигнал —> рецептор —> —> активация протонных каналов —> подкисление цитозоля —> —> активация МАР-киназ —> активация факторов регуляции транскрипции —> изменение программы экспрессии генов.
Обнаружены также активные при пониженных значениях рН изоформы фосфолипазы Д [Munnik et al., 1995] и аде-нилатциклазы [Carricarte et al., 1988], что может рассматриваться в качестве аргумента в пользу существования протонной системы. С другой стороны, эти эффекты можно расценивать лишь как рычаг дополнительной активации подкис-лением цитозоля элиситориндуцируемых фосфатидатной, МАР-киназной и аденилатциклазной сигнальных систем. Имеются также данные о том, что ингибиторы МАР-киназ приводят к подавлению подщелачивания внеклеточной среды, вызванного действием элиситоров [Zhang et al., 1998]. В этом случае не протонный импульс находится "выше по течению" сигнальной системы, а МАР-киназное звено.
Важным представляется решение вопроса о том, из какого источника протоны поступают в цитозоль. С одной стороны, имеются данные, что взаимодействие элиситоров с липидной фазой плазмалеммы может приводить к неспецифическому входу протонов снаружи внутрь клетки и к подкислению цитозоля [Klusener, Weiler, 1999]. С другой стороны, показано, что после контакта клеток с элисито-ром подкисление цитозоля и ядерной области происходит в первую очередь за счет подщелачивания вакуоли [Roos et
al., 1998]. "Протонная вспышка" начиналась практически без лаг-фазы и продолжалась в течение десятков минут. Истощение вакуолярного протонного пула предотвращало как элиситорное подкисление цитозоля, так и синтез фито-алексинов. Подщелачивание внеклеточной среды обнаруживалось только при более высоких концентрациях элиситора. По мнению авторов, подкисление цитозоля за счет выхода протонов из вакуоли - необходимый и достаточный шаг в сигнальной системе синтеза фитоалексинов. Насыщало образование фитоалексинов в суспензионных клетках мака изменение концентрации протонов, соответствующее 0,6 единицы рН.
Протонные каналы и Н+-АТФазы не были обнаружены в мембранах ядерной оболочки [Matzke et al., 2001], в отличие от кальциевых каналов и помп, что свидетельствует о принципиальных различиях в механизмах регуляции концентрации этих ионов в ядрах клеток, по сравнению с вакуолями.
Преходящий характер протонной вспышки объясняется усиливающимся при подкислении цитозоля (рис. 34) функционированием протонных помп (Н+-АТФаз) плазмалеммы |Palmgren, 1991] и тонопласта. Можно отметить, что АТФа-за была первым клонированным мембранным белком растений. В настоящее время уже многие растительные АТФа-зы клонированы (например, у арабидопсиса - более 40) и подразделяются на пять типов [Palmgren, Harper; 1999; Palmgren, 2001]. Структура Н+-АТФаз проще, чем у других ионных помп, и в большинстве случаев содержит только одну каталитическую субъединицу. Трансмембранный домен представлен десятью спиралями, причем и N- и С-концы полипептида обращены в цитозоль. АТФазы имеют регуля-торные домены (в том числе автоингибиторные) на С-кон-це молекулы и, по-видимому, места связывания с регуля-торными белками, в первую очередь с белком 14-3-3 (активирующим разнообразные ферменты). Предполагается, что важную роль в активации Н+-АТФаз играет их фосфо-рилирование протеинкиназами, но, с другой стороны, обнаружена и их активация при дефосфорилировании.
Интересно, что работа Н+-АТФаз плазмалеммы стимулировалась Са2+-активируемыми протеинкиназами [Schaller, Oecking, 1999]. Если иметь в виду, что обычно под влиянием элиситоров происходит одновременное повышение содержа-
Рис. 34. Схема участия протонных каналов и помп в преходящем подкислении цитозоля
1 и 2 - Н+-каналы; 3 и 5 - протонные помпы; 4 - Н+/Са2+-антипор-тер; ПЛ - плазмалемма; Р - рецептор
ния протонов и ионов кальция в цитоплазме, то опосредованная стимуляция последними Н+-АТФаз может играть роль дополнительного рычага снижения содержания протонов.
Основное назначение Н+-АТФаз - перенос протонов против градиента концентрации, создание трансмембранного протонного градиента и, в связи с этим, электрогенного мембранного потенциала (положительного снаружи и отрицательного с внутренней стороны плазмалеммы).
Итак, можно сделать вывод, что за элиситориндуцирован-ной активацией протонных каналов следует интенсификация функционирования протонных помп. Необходимо, однако, заметить, что имеются также данные об элиситориндуцируемом подавлении Н+-АТФаз как причине подкисления цитозоля.
МЕХАНИЗМЫ ПАТОГЕНИНДУЦИРУЕМОЙ СМЕРТИ КЛЕТОК
Одним из распространенных результатов взаимодействия патогенов и растений являются локальные разрушения клеток в инфицированных участках тканей хозяина. Видимая картина этого - появление темных, бурых, иногда светлых пятен в местах проникновения в ткань патогенов.
Существуют два типа смерти клеток, вызываемые различными непосредственными причинами и осуществляющиеся по различным сценариям. Первый и наиболее простой - это некроз клеток, который происходит благодаря нарушению целостности плазмалеммы и других мембран клеток, что приводит к невосстанавливаемым нарушениям трансмембранных ионных градиентов плазмалеммы, освобождению лизосомальных ферментов, вызывающих деградацию белков, нуклеиновых кислот и липидов. Наблюдается также снижение интенсивности синтеза АТФ в хлороплас-тах и митохондриях.
Одними из главных ультраструктурных проявлений некроза являются набухание клеток, лизис их составляющих, разрушение плазмалеммы и вытекание содержимого клеток [Cohen, 1993]. Этот процесс не регулируется генетическим аппаратом.
Второй тип гибели клеток - это генетически программируемая смерть (апоптоз), вызванная действием элиситоров и опосредованная сигнальными системами [Dangl et al., 1996; Greenberg, 1997; Hammond-Kosack, Jones, 1997; Mittler et al., 1997; Pennell, Lamb, 1997; Green, 1998; Lam et al., 1999; Самуилов и др., 2000; Shirasu, Schulze-Lefert, 2000]. Кстати, апоптоз может быть вызван тем же агентом, что и некроз, например перекисью водорода, но в последнем случае требуется гораздо большая концентрация агента. О начале процесса можно
судить по изменению ультраструктуры: вакуолизации [Shirasu, Schulze-Lefert, 2000] и съеживанию цитоплазмы, вздутиям ядерной оболочки, фрагментации ядер, конденсации хроматина [Aoyagi et al.,1998; Gao, Showalter, 1999], уплотнению матрикса митохондрий и т.д. Необходимо отметить, что плазмалемма сохраняет свою целостность. Апопто-зу подвергаются клетки, окружающие инфицированный участок, причем наибольшей восприимчивостью отличаются клетки, примыкающие к проводящим пучкам листьев. Апоп-тоз и, вследствие этого, высыхание клеток создают механический барьер для распространения инфекции по растению, в том числе системно по проводящим путям.
Принципиально важен вопрос о том, участвуют в процессе апоптоза белки, уже имевшиеся в клетках до восприятия ими элиситора - сигнала смерти, или этот сигнал вызывает экспрессию генов апоптоза с помощью сигнальных систем, и уже затем образовавшиеся протеазы, нуклеазы и другие ферменты апоптоза приводят к смерти клетки. Вторая возможность подтверждается тем, что процесс апоптоза подавляется при действии на клетки ингибиторов синтеза белков, например циклогексимидом. Известны гены, экспрессия которых приводит к апоптозу клеток у животных и растений; он не происходит, если синтез белков подавлен с помощью ингибиторов [Greenberg, 1996; Mittler et al., 1997].
В исследовании процесса апоптоза все большую роль играют параноидные мутанты растений, образующие некротические пятна самопроизвольно, без действия патогенов, и трансгенные растения с привнесенными генами апоптоза или генами ферментов, влияющих на содержание небелковых соединений, принимающих участие в процессе апоптоза, например интермедиатов сигнальных систем, таких как салициловая кислота.
Культура клеток - хорошая модель для изучения апоптоза [McCabe, Leaver, 2000], так же как трансгенные растения со спонтанным образованием апоптозных пятен без действия патогенов [Mittler, Rizhsky, 2000].
Исследования апоптоза вышли на новый, более высокий уровень после установления основополагающих фактов генетического контроля за протеканием апоптоза у нематоды Caenorhabditis elegans. Оказалось, что этот контроль осуще-
ствляется тремя основными генами: ced-3, ced-4 и ced-9 (аббревиатура от С. elegans death). Первый кодирует каспазы, третий - белок-ингибитор каспаз, гомологичный белкам семейства Вс1-2 (например, Bcl-xL) у млекопитающих. Для осуществления своих функций ингибитор каспаз нуждается в белке, кодируемом геном ced-4, действующим в качестве моста между каспазой и ее ингибитором. Существует и несколько вспомогательных генов ced. Эндогенные белковые активаторы апоптоза - Bad, Bax и Bcl-Xs, ингибиторы -Вс1-2 и Bcl-XL.
Основной механизм апоптоза у животных и растений консервативен, но в геноме арабидопсиса отсутствуют многие гены, кодирующие регуляторы апоптоза, характерные для человека, червей, насекомых, что показывает, что растения используют и другие регуляторы для контроля над этим процессом [Lam et al., 2001]. В то же время обработка кеточной суспензии томатов химическими индукторами апоптоза животных клеток приводила к апоптозу и клеток растений [De Jong et al., 2000].