ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 01.12.2019
Просмотров: 3397
Скачиваний: 3
На основе хитозана 5 кДа создан препарат "Агрохит", рекомендуемый для защиты картофеля от фитофтороза, но, по-видимому, достаточно эффективный в защите и от других патогенов.
Молекулярные механизмы и практические аспекты использования хитозана для повышения устойчивости растений к различным патогенам обсуждались на 6-м Международном симпозиуме по хитину и хитозану, проведенном в Москве в 2001 г.
Практическое применение получили препараты на основе стрессовых фитогормонов и их синтетических анало-
гов. Достаточно широкое распространение получили препараты на основе 2-хлорэтилфосфоновой кислоты (2-ХЭФК), пролонгированно освобождающие фитогормон этилен: амхел, этрел, кампозан, флорел, гидрел, дигидрел [Кораблева, Платонова, 1995]. Установлено, что обработка этими препаратами растений картофеля и клубней перед закладкой на хранение усиливает покой клубней и их устойчивость к фитопатогенным микроорганизмам и улучшает качество семенного материала [Метлицкий и др., 1982а; Кораблева и др., 1989]. Положительные результаты от применения препаратов-доноров этилена были получены и при хранении лука и моркови [Карякина и др., 1990; Кораблева, Платонова, 1995].
Повышение устойчивости к болезнями продемонстрировано при использовании препаратов брассиностероидов и их аналогов [Кораблева, Платонова, 1995].
Начинается практическое использование еще одного стрессового гормона - жасмоната (и его производного - ме-тилжасмоната) [Зиновьева и др., 1998].
Давно известно, что экзогенный стрессовый фитогормон салициловая кислота (являющаяся также интермедиа-том НАДФН-оксидазной и NO-синтазной сигнальных систем) и ацетилсалицилат вызывают синтез защитных соединений и повышение устойчивости растений к патогенам. Практическое использование нашел природный миметик салициловой кислоты [Тарчевский и др., 1999] — янтарная кислота.
Уже давно было отмечено, что янтарная кислота является биологически активным соединением [Благовещенский, 1968]. Нами в полевых условиях на более чем 10 тыс. га и в тепличных хозяйствах на многих сельскохозяйственных культурах было показано, что предпосевная обработка семян или вегетирующих растений препаратами янтарной кислоты приводит к повышению интенсивности продукционных процессов и урожаев растений, что в значительной степени связано с их устойчивостью к болезням.
Технология получения янтарной кислоты, не содержащей примесей тяжелых металлов, была разработана в Казанском химико-технологическом институте в лаборатории профессора А.Г. Лиакумовича, и было начато производство препаратов на основе этого соединения.
Технология использования тех или иных элиситоров, ннтермедиатов сигнальных систем и стрессовых фитогор-монов по отдельности или в сочетаниях должна быть разработана применительно к конкретным видам и сортам растений [Озерецковская, Васюкова, 2002], в противном случае может быть получен результат, противоположный ожидаемому.
ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ
С ИЗМЕНЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ
К ПАТОГЕНАМ
Успехи молекулярной генетики, появление эффективных методов переноса в растения "чужих" существующих в природе и искусственно конструируемых генов, клонирование генов, изучение структурных и функциональных особенностей генов и их промоторных участков обеспечили большие возможности в создании трансгенных растений специально для изучения особенностей функционирования сигнальных систем клеток растений. Кроме того, трансгенные сельскохозяйственные растения с привнесенными генами элиситоров, интермедиатов сигнальных систем и элиситориндуцируемых белков оказались более устойчивыми к патогенам и стали использоваться в практических целях. В настоящее время ими заняты значительные посевные площади. Работы в этой области продвигаются настолько интенсивно, что появилась необходимость систематизировать их и ознакомить с ними специалистов, работающих в области физиологии растений и смежных направлениях науки.
Эффективность работ по созданию трансгенных растений в значительной степени определялась результатами исследований молекулярных основ адаптации и иммунитета, соответственно, к абиотическим и особенно к биотическим стрессорам.
При изучении особенностей влияния патогенных микроорганизмов на растения было обнаружено образование в атакуемых тканях патогениндуцируемых защитных белков (PR) [Neumann et al., 1989; Stintzi et al., 1993]. Оказалось, что эта реакция в определенной степени неспецифична: многие защитные белки образуются при атаке на растения самых
разнообразных патогенных грибов, бактерий, вирусов, а также насекомых и паразитирующих на растениях круглых червях - нематодах. Последнее можно рассматривать и как приспособительную реакцию против последующего инфицирования растений через образовавшуюся раневую поверхность.
Патогены, продуцируемые ими и инфицированными растениями элиситоры, "включают" сигнальные системы клеток [Тарчевский, 2000], которые осуществляют рецепцию, преобразование и усиление элиситорного сигнала и передачу его в геном, где происходит экспрессия генов защитных белков, что обеспечивает появление локальной и системной устойчивости. В предыдущем разделе все пато-ген(элиситор)индуцируемые белки были подразделены на несколько групп по тем функциям, которые они выполняют [Тарчевский, 2001].
Для создания устойчивых к биогенным стрессорам трансгенных растений используются гены белков - участников сигнальных путей клеток. К ним относятся белковые элиситоры; интермедиаты сигнальных систем, например ферменты, катализирующие синтез или деградацию вторичных мессенджеров; белки, обеспечивающие устойчивость самого растения-хозяина или нарушение функций па-тогеных микроорганизмов, растительноядных насекомых или нематод.
Очевидно, что чем более раннее звено сигнальной цепи клетки растения кодирует переносимый ген (например, ген элиситорного белка), тем менее специфичным и более разнообразным будет набор изменений в функционировании трансгенного растения, обеспечивающих появление повышенной устойчивости к стрессорам. Можно ожидать, что более направленной и специфичной будет защита растений, вызванная переносом в них генов белков прямого антипатогенного действия, являющихся заключительным звеном функционирования сигнальных цепей.
Обычно практикуется прикрепление переносимого гена к промотору другого гена растения (рис. 55) - к конститутивно функционирующему или, чаще всего, эффективно изменяющему активность под влиянием воздействия на растения того или иного стрессора. Иногда с целью большего повышения устойчивости трансгенного растения в
1 - промоторная область; 2 — соответствующий промотору "свой" ген; 3 - чужеродный ген; 4 и 5 - два чужеродных гена под контролем одного промотора; 6 -репортерный ген; 6 и 7 - два ре-портерных гена под контролем одного промотора; 2 и 7 - "свой" и репортерный гены под контролем одного промотора
него могут переносить не один, а различные гены [Zhu et al., 1996].
Трансгенные растения с репортерными генами. Для исследования сигнальных систем используют трансгенные растения, у которых к промотору гена, установленного ранее или предполагаемого участника сигнальной системы, прикрепляется так называемый репортерный ген, кодирующий белок, активность которого может быть определена, например белок, обладающий способностью люминесциро-вать в присутствии определенных люминофоров. Чаще всего репортерный ген присоединяется к промоторному участку исследуемого гена. Интенсивность экспрессии репортер-ных генов и распределение по органам растения или внутри клеток кодируемых ими белков достаточно легко исследовать по люминесценции. В большинстве случаев в качестве репортерного используется ген фермента (3-глюкуронида-зы (GUS) из энтеробактерии Е. coli. Фермент гидролизует Р-£)-глюкурониды, превращая их в D-глюкуроновую кислоту и агликоновый фрагмент, но может также отщеплять от полисахаридов остаток (3-глюкуроновой кислоты, связанный с сахарами [Gilissen et al., 1998]. Фермент проявляет активность в форме гомотетрамера, обычно локализуется в цитоплазме, но с помощью введения в репортерный ген последовательности нуклеотидов, кодирующей транспортный пептид, можно позволить ферменту перенос через мембраны и накопление, например, в эндоплазматической сети. Качественный, количественный и гистохимический анализы активности GUS проводятся с помощью коммерческих препаратов глюкуронидов по люминесценции продуктов
реакции в присутствии люминофоров. Этот подход оказался эффективным при изучении сигнального пути, "включаемого" элиситорными белками - элиситинами. Оказалось, что молекула элиситина имеет два отличающихся участка структуры, один из которых определяет сигнальный путь, ведущий к синтезу защитных белков, а другой - к индукции некрозов [Perez et al., 1997]. Репортерный ген GUS применялся также для определения структуры промоторов, например, отвечающих за экспрессию генов этилениндуциру-емых защитных белков [Eyal et al., 1993], для изучения особенностей регуляции сигналиндуцируемого синтеза супер-оксиддисмутазы [Herouart et al., 1994], каталазы [Guan, Scandalios, 1993], анионных пероксидаз и их локализации в различных органах растений [Mohan et al., 1993a, b; Klotz et al., 1998; Gray-Mitsumune et al., 1999], обогащенных гид-роксипролином белков клеточных стенок [Wycoff et al., 1995; Puigdomenech et al., 1997], msr (multiple stimulus response) генов, от которых зависит апоптоз [Pontier et al., 1998], осмо-тинов [Zhu et al., 1995; 1996], дефенсинов [Manners et al., 1998; Mitter et al., 1998], PR1 защитных белков [Tornero et al., 1997], протеаз [Jorda, Vera, 2000], хитиназ [Clarke et al., 1994; Leah et al., 1994; Shinshi et al., 1995], р-1,3-глюканаз [Castresana et al., 1990; Vogeli-Lange et al., 1994; Alonso et al., 1995], стриктозидин-синтазы - ключевого фермента элиси-ториндуцируемого образования терпеноидных алкалоидов [Memelink et al., 1999], а также ферментов синтеза фенил-пропаноидных фитоалексинов - фенилаланин-аммиак-лиа-зы и сесквитерпенциклазы [Yin et al., 1997], 4-кумарат-ко-фермент А-лигазы [Hauffe et al., 1991]. Введение гена (3-глюкуронидазы помогло понять, как распределяется по органам и тканям калретикулиновый ген [Coughlan et al., 1997], изменяющий активность в ходе развития растений, и моносахаридный Н+-симпортерный ген [Truernit et al., 1996], экспрессируемый при действии патогенов и элиситоров. С помощью гена GUS удалось установить, что экспрессия белка оболочки вируса, обеспечивающего его транспортировку по растению, локализована в тканях флоэмы вегетативных органов [Christou et al., 2000]. Это объясняет, почему скорость распространения вируса по растению значительно увеличивается после его попадания во флоэму из клеток мезофилла листа [Курсанов, 1976]. Использование