ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 01.12.2019
Просмотров: 3443
Скачиваний: 3
(3-1,3-Глюканаза-» мРНК
Рис.
54. Схема элиситориндуцируемого образования
клетками растений
белков прямого антипатогенного действия
ДФ - дефенсины; К - кутикула; КС - клеточные стенки; ПК - про-теинкиназы; Пр - протеиназы; РИБ - рибосомоинактивирующие белки; ФРТ - факторы регуляции транскрипции
каназ не только разрушать клеточные стенки грибов, но и продолжать деградацию освобождающихся фрагментов хитина и (3-1,3-глюканов, снижая их элиситорные способности [Salzer et al., 1997].
Патогениндуцируемые белки растений, нарушающие функционирование клеточной мембраны патогенов. Под влиянием инфицирования и ряда других неблагоприятных факторов в растениях быстро образуются модификаторы свойств клеточных мембран патогенных грибов и бактерий (см. рис. 54) - относительно небольшие (от 2 до 9 кДа) полипептиды, подразделяемые на целый ряд семейств: тиони-ны, дефенсины, липидпереносящие белки, хевеины, ноти-ны, снейкины и др. [Garcia-Olmedo et al., 1998]. Список бактерицидных и фунгицидных полипептидов продолжает пополняться. Все они имеют идентичный план строения - несколько дисульфидных мостиков, гидрофобное ядро, одну протяженную а-спираль и три или четыре антипараллель-но расположенных небольших (3-полос [Song et al., 1997; Garcia-Olmedo et al., 1998; Fant et al., 1999]. Так, у одного из
тионинов - у-1-пуротионина [Bruix et al., 1995], насчитывается четыре дисульфидных мостика, а-спираль, включающая участок полипептида от 16 до 28 аминокислоты, три Р-полосы, включающие 1-6-, 31-34- и 39^7-остатки аминокислот. У вискотоксина дисульфидные мостики соединяют 3 и 40, 4 и 32, 16 и 26 остатки цистеина [Orru et al., 1997], а у у-тионина из сорго - 3 и 47, 14 и 34, 20 и 41, 24 и 43 [Nitti et al., 1995].
Примечателен факт принципиального сходства строения и относительно высокой гомологии отдельных участков этих полипептидов с нейротоксинами скорпиона и де-фенсинами насекомых, что свидетельствует об эволюционной стабильности этих важных защитных соединений [Zinn-Justin et al., 1996; Thevissen et al., 1997; Kushmerick et al., 1998]. Следует ожидать, что взаимодействующие с ними рецепторы клеточной мембраны бактерий и грибов также обладают консервативной структурой.
Образование дефенсинов растений индуцируется не только патогенами, но и промежуточными продуктами сигнальных систем клеток и некоторыми стрессовыми фитогормонами, например МеЖК и этиленом [Terras et al., 1998; Shah et al., 1999], однако регуляция этими соединениями экспрессии генов различных дефенсинов может сильно отличаться. Так, МеЖК не действовал на синтез некоторых изоформ дефенсинов [Epple et al., 1997]. Как правило, салициловая кислота также не индуцировала образования дефенсинов [Epple et al., 1997; Terras et al., 1998; Shah et aL, 1999].
При выяснении причин ингибирующего действия на грибы тионинов и дефенсинов было обнаружено, что они вызывают изменение мембранного потенциала клеточной мембраны гриба [Froy, Gurevitz, 1998], усиливают поглощение Са2+, выход К+, подщелачивание среды [Thevissen et al., 1996; De Samblanx et al., 1997], ингибируют №+-кана-лы [Kushmerick et al., 1998]. Дефенсины, тионины и липидпереносящие белки в разной степени вызывали аггрега-цию и усиление проницаемости для различных веществ искусственных фосфолипидных липосом [Caaveiro et al., 1997]. Считается, что тионины могут подавлять рост грибов, непосредственно (неспецифически) действуя на их клеточные мембраны, а дефенсины - связываясь с распо-
ложенными в них специфическими рецепторами [Thevissen et al., 1996].
Интересно, что грибы в ответ на действие дефенсинов включают пока еще неизвестный механизм подавления их образования у растений [Sharma, Lonneborg, 1996]. Этот феномен проявляется через сутки и более после начала действия антигрибных полипептидов на грибы и является еще одним подтверждением гипотезы генетического пинг-понга между патогеном и хозяином.
Патогениндуцируемые белки растений, вызывающие нарушение процессов трансляции у патогенов. Рибосомо-инактивирующие белки (РИБ) относятся к широко распространенным [Gasperi-Campani et al., 1985; Stirpe, Barbieri, 1986; Barbieri et al., 1993; Citores et al., 1993; и др.] защитным антибиотическим стрессовым белкам, синтез большинства которых начинается после воздействия на растения биогенных и абиогенных стрессоров [Stirpe et al., 1996; Rippmann et al., 1997; и др.] (см. рис. 54). Следует отметить, что некоторые из РИБ синтезируются конститутивно, например в семенах и плодах многих растений [Vigers et al., 1991], где вместе с другими белками (хитиназами, [3-1,3-глюканазами, ингибиторами протеиназ) обеспечивают защиту от бактерий, грибов и вирусов. В последние годы РИБ привлекли к себе особое внимание, так как обнаружилось, что они обладают противоопухолевой активностью [Langer et al., 1999; Sharma et al., 1999].
В настоящее время известны десятки патогениндуциру-емых представителей РИБ у растений различных семейств. Названия этих РИБ обычно отражают родовую или видовую принадлежность растений: аспарины из Asparagus offi-cinalis [Bolognesi et al., 1990], волкенсин из Avenia volkensii [Sparapani et al., 1997], бриодины из Bryonia dioica [Bolognesi et al., 1990], колоцины из Citrullus colocynthis [Bolognesi et al., 1990], диантин из Dianthus caryophyllus [Hong et al., 1996], гелонин из Gelonium multiflorum [Brigotti et al., 1999], луф-фины и луффацилин из Luffa cylindrica [Brigotti et al., 1995], лихнин из Lychnis chalcedonica [Bolognesi et al., 1990; Brigotti et al., 1995], мапалмин из Manihot palmata [Bolognesi et al.,1990], MOR и MOR 1 из Marah oreganus [Bolognesi et al., 1996], момордины [Bolognesi et al., 1996], моморхарины
| Mock et al., 1996; Wang, Ng, 1998] и моморкохин [Bolognesi ct al., 1990] из Momordica charantia, фитолакцин из Phytolacca americana [Barbieri et al., 1992], рицин из Ricinus communis [Wang, Ng, 1998; Sharma et al., 1999], эбулитины из Sambucus ebulus [De Benito et al., 1995], нигритины и ниг-рины из Sambucus nigra [Battelli et al., 1997], сапорины из Saponaria officinalis [Bolognesi et al., 1996], кириловины и трихокирин из Trichosanthes kirilowii [Brigotti et al., 1995], тритины из Triticum aestivum [Brigotti et al., 1995], синамо-мин и камфорин из Cinnamomum camphora [Li, Chory, 1997] и т.д.
Определение первичной структуры многих РИБ показало, что они обладают более или менее хорошо выраженной гомологией [Funatsu et al., 1991; Wang, Ng, 1998] и что все они могут быть подразделены на два основных типа: одно-цепочечные (РИБ I) и двухцепочечные (РИБ II). Некоторые из них гликозилированы [Di Maro et al., 1999]. Молекулярные массы большинства РИБ находятся в пределах 28-32 кДа. Защита против патогенных бактерий и грибов обеспечивается ингибирующим действием РИБ на процесс трансляции в рибосомах, а именно блокированием фактора элонгации [Citores et al., 1993]. Специальные исследования молекулярного механизма подавления трансляции позволили установить, что РИБ вызывают расщепление N-связи между рибозой и аденином, причем в специфическом нук-леотиде А-4256, который находится в петле 28S в рибосо-мальной РНК, входящей в состав 60S субъединицы рибосомы [Fong et al., 1991; Brigotti et al., 1999]. Считается, что де-иуринизация нуклеотида А-4256 нарушает динамическую гибкость структуры рибосом, которая необходима для осуществления синтеза очередной пептидной связи [Holmberg, Nygard, 1996].
Накапливается все больше фактов не только о N-глико-шдазной, но также о суперспиральзависимой эндонуклеаз-ной [Liu, Pu, 1999], РНКазной [Obrig et al., 1985; Mock et al., 1996], ДНКазной [Nicolas et al., 1998] активностях РИБ. Обнаружен также новый фермент - сайт-специфическая рРНК-лиаза, которая способна расщеплять молекулу РНК на 3'-участке апуринового сайта [Ogasawara et al., 1999] и работающая в комплексе с N-гликозидазой, обеспечивая не
только точечное видоизменение, но и последующее разрушение рибосомной РНК патогенов. У одного из РИБ -камфорина, обнаружена супероксиддисмутазная активность [Li, Chory, 1997].
Получены любопытные данные о связи структуры некоторых РИБ с другими стрессиндуцируемыми белками. Так, N-концевой участок одного из РИБ типа I отличался от аналогичного участка хитиназы лишь одной аминокислотой [Di Maro et al., 1999]. Обнаружена гомология между N-концом жасмонатиндуцируемого белка 60 кДа и каталитическим доменом одного из РИБ [Fong et al., 1991]. Оказалось, что последний может образовываться из белка 60 кДа в ходе двухступенчатого процессинга.
Многие РИБ вызывают гибель не только грибов и бактерий, но и клеток растений и животных [Chaudhry et al., 1994; Bolognesi et al., 1996]. В клеточной мембране найден специфический РИБ I-связывающий белок, причем РИБ I не проникает через плазмалемму в неинфицированные протопласты, в отличие от инфицированных вирусами, что предотвращает их размножение [Watanabe et al., 1997]. РИБ I проявляют гомологию с А-цепью РИБ II [Wang, Ng, 1998], обладающей каталитической активностью, а проникновение РИБ II в клетки (перенос А-цепи) обеспечивается с помощью В-цепи, отвечающей за узнавание специфических рецепторных белков клеточной мембраны [Sharma et al., 1999]. В-цепь обладает галактозоспецифичным лектино-вым доменом, узнающим галактозные остатки на поверхности клеточной мембраны [Chaudhry et al., 1994].
Гены перечисленных в разделе десятков белков обладают определенной видовой, тканевой и органоидной специфичностью. Вид и интенсивность синтеза белков зависят от природы элиситорных сигналов и времени, прошедшего после начала их действия. Можно быть абсолютно уверенным, что в одном опыте на определенном объекте исследователь не сможет обнаружить значительную часть этих белков. В этом отношении представляется показательным исследование пространственных и временных характеристик транскриптов различных белков, образующихся в листьях бобов в месте инокуляции патогенных бактерий и на различном расстоянии от него [Meier et al., 1993]. В мес-
те инокуляции обнаруживались мРНК хитиназ, фенилала-нин-аммиак-лиазы, халконсинтазы, в небольшой степени -липоксигеназ. На расстоянии 0,5- 0,7 см от места инокуляции было зарегистрировано высокое содержание мРНК липоксигеназ, не было найдено мРНК халконсинтазы и лишь в небольших количествах обнаруживались мРНК хитиназы и фенилаланин-аммиак-лиазы. На еще большем удалении можно было найти лишь мРНК липоксигеназ, но их содержание было достаточно высоким. Естественно, что по мере увеличения времени действия патогенов системные элиси-горные сигналы распространяются на все большее расстояние и в удаленных от места инфекции клетках индуцируется синтез защитных белков и фитоалексинов.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭЛИСИТОРОВ И ИНТЕРМЕДИАТОВ СИГНАЛЬНЫХ СИСТЕМ
КЛЕТОК ДЛЯ СОЗДАНИЯ ПРЕПАРАТОВ,
ПОВЫШАЮЩИХ УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ
К ПАТОГЕНАМ
Материалы, приведенные в предыдущем разделе, свидетельствуют, что элиситоры, интермедиаты сигнальных систем и стрессовые фитогормоны индуцируют образование большого набора защитных белков, в том числе ферментов, катализирующих образование антипатогенных веществ небелковой природы. Некоторые из защитных соединений повышают устойчивость самих растений, другие оказывают ингибирующее действие на развитие патогенов.
Все это приводит к снижению отрицательного действия патогенов на продукционные процессы и урожай растений, что не могло не обратить на себя внимания. Было предложено достаточно много рекомендаций практического использования препаратов, содержащих природные элиситоры, интермедиаты сигнальных систем и стрессовые фитогормоны или их химические аналоги. Часть этих предложений запатентована, и налажены выпуск и реализация анти-фитопатогенных препаратов.
Из элиситоров чаще всего использовались арахидоновая кислота и производные хитина - олигохитозаны. В качестве сырья для получения арахидоновой кислоты используют морских животных и некоторые органы теплокровных животных. Первый препарат для повышения устойчивости растений к патогенам на основе арахидоновой кислоты был предложен более 20 лет тому назад [Метлицкий и др., 1978, 19826; Озерецковская, 1994]. Установлено, что после предпосевной обработки клубней картофеля или листьев в пе-
риод бутонизации значительно повышалась комплексная устойчивость к фитофторозу, ранней сухой пятнистости, ризоктониозу и парше. Прибавка урожая составляла в среднем 25%. Обработка арахидоновой кислотой защищала клубни картофеля и при хранении [Чаленко и др., 2001]. Защитное действие арахидоновой кислоты от фитопатогенов было подтверждено при исследовании ее действия на томаты и сахарную свеклу [Метлицкий, Озерецковская, 1985].
Установлено, что арахидоновая и эйкозапентаеновая кислоты индуцируют не только локальную, но и системную пролонгированную устойчивость картофеля к возбудителю фитофтороза [Чалова и др., 1989]. Было также обнаружено, что арахидоновая кислота повышает устойчивость к нематодам при выращивании растений в теплицах [Зиновьева и др., 1996], особенно в сочетании с метилжасмонатом [Зиновьева и др., 1998].
В Российской Федерации налажен производственный выпуск антипатогенных препаратов на основе арахидоновой кислоты.
В последние годы широко испытывается действие на устойчивость растений к патогенам еще одного элиситора -хитозана. Обнаружено, что максимальная фитофтороус-тойчивость картофеля проявляется при использовании водорастворимого хитозана с молекулярной массой 5 кДа [Переход и др., 1997; Васюкова и др., 2000]. Хитозан повышал также устойчивость к нематодам растений томатов в условиях тепличного хозяйства [Зиновьева и др., 1999], причем индуцировал не только локальную, но и системную устойчивость растений к фитофторе и нематодам [Васюкова и др., 2001].