ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 01.12.2019
Просмотров: 3403
Скачиваний: 3
Второй тип протеинкиназ фосфорилировал полипептиды 59, 19, 16 и 14 кДа.
Экзогенный цАМФ вызывал изменения (в основном, ин-гибирование) фосфорилирования ряда полипептидов хло-ропластов, опосредованного участием протеинкиназ [Khurana et al, 1996].
Один из первых генов протеинкиназы, клонированных в растениях, был похож на семейство протеинкиназ А животных по последовательностям нуклеотидов [Lowton et al., 1989]. Имеются примеры сходства аминокислотных последовательностей протеинкиназ А из растений (их гомологию) с протеинкиназами А животных. Несколько групп исследователей сообщили о клонировании генов, гомологичных гену протеинкиназы А (обзорные работы: [Assman, 1995; Stone, Walker, 1995]). Протеинкиназа из петунии фосфорилировала специфичный синтетический субстрат протеинкиназы А [Polya, Bovman, 1991]. Сообщалось о том, что добавление цАМФ к экстрактам растений стимулирует фосфорилирова-ние специфичных белков [Assman, 1995]. Исследование мест фосфорилирования в фенилаланин-аммиак-лиазе (ФАЛ) -ключевом ферменте биосинтеза фитоалексинов, обнаружило сайты, специфичные для протеинкиназы A [Bolwell, 1995].
Использование высокоспецифичного белкового ингибитора (БИ) цАМФ-зависимых протеинкиназ [Walsh et al., 1971] позволило подтвердить предположение [Newton, Brown, 1986], что цАМФ-зависимые протеинкиназы могут быть активированы эндогенным цАМФ еще в процессе приготовления образца: БИ подавлял базальную протеин-киназную активность экстрактов из листьев в разных опытах на 30-50% [Каримова, 1994]. Интермедиаты липоксиге-назной сигнальной системы ГДК и МеЖК активировали в присутствии цАМФ протеинкиназную активность на 33-^8% [Каримова и др., 19996]. Салициловая кислота индуцировала повышение уровня цАМФ-зависимой фосфори-лированности полипептидов 74, 61 и 22 кДа в листьях гороха [Мухаметчина, 2000]. цАМФ-стимулируемая протеинки-назная активность растворимых белков листьев гороха зависела от концентрации Са2+ [Каримова и др., 1989; Тар-чевская, 1990; Каримова, Жуков, 1991], причем ферментативная активность обнаруживалась также в изолированных клеточных стенках, ядрах, плазматических мембранах.
В растениях найдены гены, кодирующие фермент про-теинфосфатазу, мишенью которой являются белки, фосфо-рилированные с помощью протеинкиназы А.
Для характеристики аденилатциклазной сигнальной системы чрезвычайно важен факт обнаружения в растениях генов, кодирующих белковые факторы регуляции транскрипции, которые имеют протяженные последовательности нуклеотидов, гомологичные CREBS - цАМФ-связываю-щему фактору транскрипции у животных [Bolwell, 1995].
Многочисленные данные о влиянии цАМФ на ионные каналы клеток растений и относительно слабая экспериментальная база представлений о возможности передачи сигналов от цАМФ через фосфорилирование белковых факторов регуляции транскрипции в геном, с одной стороны, укрепляют позиции сторонников существования непрямого (через активацию ионных каналов) сигнального аденилат-циклазного пути и, с другой, заставляют усилить попытки получения доказательств функционирования прямого цАМФ-сигнального пути.
МАР-КИНАЗНАЯ СИГНАЛЬНАЯ СИСТЕМА
Митогенактивируемые серин-треонинового типа про-теинкиназы (МАРК) и МАР-киназный сигнальный каскад (сигнал —> рецептор —> G-белки —> МАРККК —» —> МАРКК —> МАРК —> ФРТ —> геном), достаточно полно изученные в животных объектах, функционируют и в клетках растений (рис. 8). Им посвящены обзорные статьи [Kultz, 1998; Jonak et al., 1999; Jouannic et al., 1999b; Meskiene, Hirt, 2000] и работы экспериментального характера, в которых сообщаются сведения об индивидуальных представителях этой сигнальной системы [Ichimura et al., 1998; Nishihama et al., 1997; Jouannic et al., 1999b] и особенностях их регуляции.
МАР-киназный каскад "включается" при митозе (чем и объясняется название этих протеинкиназ), при обезвоживании [Mizoguchi et al., 1996; Тепа, Renaudin, 1998], гипоосмо-тическом стрессе [Cazale et al., 1998], низкой температуре [Jouannic et al., 1999b], механическом раздражении растений [Mizoguchi et al., 1996], повреждении тканей [Seo et al., 1995; Bogre et al., 1997; Morris et al., 1997], окислительном стрессе [Kovtun et al., 2000], действии патогенов [Zhang, Klessig, 1998a; Meskiene, Hirt, 2000], элиситоров [Suzuki, Shinshi, 1995; Ligterink et al., 1997; Kultz, 1998; Zhang et al.,1998] (в том числе харпинов [Adam et al., 1997], криптогеина [Lebrun-Garcia, 1998], олигосахаридов [Zhang et al., 1998]), стрессовых фитогормонов жасмоната [Seo et al., 1995; 1999], сали-цилата [Zang, Klessig, 1997; 1998], системина [Meindl et al., 1998], этилена [Meskiene, Hirt, 2000]).
Зависимость функционирования МАР-киназного каскада от различных воздействий нашла отражение в названиях некоторых МАР-киназ, например WIPK и SIPK (соответственно wound-induced protein kinases и salicylate-induced protein
Рис. 8. Схема функционирования МАР-киназной сигнальной системы
ККМАРК - киназа киназы МАР-киназы; КМАРК - киназа МАР-киназы; МАРК - митогенактивируемая протеинкиназа. Остальные обозначения - см. рис. 6
Время после повреждения, мин
Рис. 9. Активация МАР-киназы механическим повреждением трехмесячного растения табака путем срезания стебля под первым снизу листом [Seo et al., 1999]
После срезания стебля в этом листе исследовали в течение 60 мин активность МАР-киназы (в контрольных растениях принятую за единицу)
kinases - индуцируемые механическим повреждением и са-лицилатиндуцируемые протеинкиназы). Оказалось, что активация WIPK осуществляется не только при повреждении тканей растений, но и при их инфицировании вирусом табачной мозаики [Zhang, Klessig, 1998a], а активация SIPK -при действии олигосахаридных элиситоров и белковых эли-ситинов [Zhang et al., 1998].
Активация МАР-киназ носит преходящий характер (рис. 9), наподобие того, что происходит с ферментами и ин-термедиатами других сигнальных систем [Seo et al., 1999].
Интересно, что ранаактивируемая МАР-киназа вызывает накопление жасмоната и метилжасмоната, по-видимому, вследствие активации ФЛА2. Участие МАР-киназной
сигнальной системы в активации липоксигеназного сигнального пути было подтверждено в специальных опытах [Meindl et al., 1998]. Так как интермедиаты липоксигеназного метаболизма вызывают апоптоз клеток растений, то не вызывает удивления, что в нем принимает участие и элиситориндуцируемый МАР-киназный каскад [Suzuki et al., 1999].
Обнаружена индукция образования транскриптов про-теинкиназ МАРК-сигнальной системы (и связанная с этим их активация) под влиянием различных стрессоров [Mizoguchi et al., 1996]. Чаще всего интермедиаты МАР-киназной сигнальной системы активируются или инактивиру-ются за счет посттрансляционной модификации, подвергаясь главным образом фосфорилированию [Romeis et al.,1999] или дефосфорилированию [Gupta et al., 1998; Meskiene et al., 1998; Meskiene, Hirt, 2000] с помощью соответствующих протеинкиназ и протеинфосфатаз.
МАР-киназная сигнальная система активируется многими внеклеточными сигналами, что объясняется большим разнообразием представителей стартового фермента в цепи киназ. Все МАРКК-киназы (МАРККК) подразделяются на четыре группы [Widmann et al., 1999; Meskiene, Hirt, 2000] в зависимости от особенностей первичной структуры, о которой стало возможным судить после клонирования соответствующих генов. Различия касаются в первую очередь структуры регуляторного домена, но они обнаружены также в других доменах, таких, например, как zinc zipper (цинковая застежка-молния), лейциновые "застежки", места связывания G-белков, несколько мест фосфорилирования тирози-новых, сериновых и треониновых остатков. Как уже отмечалось, в соответствии с разнообразием структуры МАРКК-киназ представители этого семейства могут активироваться различными источниками сигналов. Это могут быть другие протеинкиназы - ПКС и МАРКККК, различные G-белки семейств Ras и Rho. MAPKK имеет более ограниченные возможности регуляции в связи с меньшей вариа-бильностью структурных элементов этих ферментов. В еще большей степени это касается МАРК. МАРККК катализирует фосфорилирование остатков серина и треонина в МАРКК, а последняя - остатков треонина и тирозина в МАРК. По всей вероятности, МАРКК активирует (путем
фосфорилирования) лишь МАРК. Можно сделать вывод, что в случае с каскадом МАРККК -» МАРКК -» МАРК мы имеем дело с сигнальной "воронкой", с конвергенцией сигнальных путей, инициируемых в пределах МАРК-системы различными элиситорами. В этом случае последнее звено этой системы - МАР-киназа, может активировать лишь один тип факторов регуляции транскрипции, вызывая экспрессию более узкого круга генов, чем можно было бы ожидать, если иметь в виду большое разнообразие МАРККК. МАР-киназа может также катализировать фос-форилирование цитоскелетных белков и фосфолипаз, активируя их.
К 2000 г. были клонированы гены 17 представителей МАРККК, МАРКК и 28 представителей МАР-киназ из различных видов растений [Ligterink, 2000]. Вполне вероятно, что во взаимодействии этих протеинкиназ определенную роль играют комплексообразующие белки типа scaffold proteins.
Как уже отмечалось выше, активация сигнальных систем носит преходящий характер, а это означает, что должны быть эффективные механизмы их самоингибирования. Инактивация МАР-киназной сигнальной системы осуществляется, в первую очередь, за счет дефосфорилирования МАРК с помощью протеинфосфатаз. Все имеющие отношение к МАР-сигнальному каскаду протеинфосфатазы подразделяются на три группы [Meskiene, Hirt, 2000]: ферменты двойной специфичности, осуществляющие дефосфо-рилирование остатков тирозина и треонина в МАР-киназах, тирозиновые протеинфосфатазы и серин-треониновые протеинфосфатазы.
ФОСФАТИДАТНАЯ СИГНАЛЬНАЯ СИСТЕМА
Следующие три раздела посвящены сигнальным системам, функционирование которых начинается с превращения мембранных фосфолипидов, катализируемого различными фосфолипазами: ФЛД, ФЛС и ФЛА2. Изначально считалось, что их активация является главной причиной обновления мембранных фосфолипидов при изменении условий существования растений, замены ранее существовавших ли-пидов на более соответствующие новым условиям. В качестве примера можно привести замену фосфолипидов с низким содержанием ненасыщенных жирных кислот на фос-фолипиды с высоким их содержанием при понижении температуры. Со временем удалось установить еще одну чрезвычайно важную функцию фосфолипаз: запуск по крайней мере трех сигнальных систем - фосфатидатной, кальциевой и липоксигеназной.
В последние годы все большее внимание уделяется сигнальной системе, "включаемой" активацией фосфолипаз Д под влиянием патогенов, элиситоров и при абиотическом стрессе [Munnik et al., 1998; Wang, 1999] (рис. 10). Так как при этом происходит освобождение из фосфолипидов фос-фатидной кислоты, то эта сигнальная система получила название фосфатидатной [Тарчевский, 2000].
Фосфолипазы Д представляют собой достаточно гетерогенное семейство белков [Qin et al., 1997; X. Wang, 2000] с большой протяженностью консервативных последовательностей аминокислот и с отличающимися участками структуры, отвечающими за особенности регуляции каждой из изоформ этого фермента, например за степень активации ионами кальция, инозитолполифосфатами или механическим повреждением тканей [С. Wang, 2000]. Интересно, что последнее воздействие вызывало наивысшую активацию
Рис. 10. Схема функционирования фосфатидатной сигнальной системы
МФЛ - мембранные фосфолипиды; ПК - протеинкиназа; ФК - фос-фатидная кислота; ФЛД - фосфолипаза Д. Остальные обозначения -см. рис. 6
предсуществующих молекул фермента у той изоформы фосфолипазы Д, для которой была характерна наименьшая экспрессия генов. По всей вероятности, эта изоформа отвечает за наиболее быстрые сигнальные события, а другие изоформы - за более поздние, поскольку на синтез ферментов de novo требуется затрата гораздо большего времени.
Лучшими субстратами для фосфолипаз Д являются фо-сфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидил-глицерол. Обнаружено, что патогены и механическое повреждение вызывают передвижение ФЛД из цитозоля к плазмалемме и повышение активности фермента (рис. 11) [Ryu, Wang, 1996]. Возможность связывания с мембранами некоторых изоформ фосфолипазы Д определяется их ми-ристоилированием, что приводит к повышению гидрофоб-ности. Привлекает внимание, что один из доменов ФЛД способен связываться с Са2+ и фосфолипидами и таким образом регулировать транспорт фермента к мембране. Домен со сходной структурой был обнаружен также у ряда других белков, принимающих участие в функционировании сигнальных систем клеток (у фосфолипаз С и А2, у протеинкиназы С).
Повышают активность части фосфолипаз Д протеинкиназа С, Са2+, тримерные G-белки и малые G-белки, полифо-сфоинозитид; снижают активность лизофосфатиды. Было обнаружено, что преходящее накопление фосфатидатной кислоты происходило и без влияния элиситоров, если на клетки воздействовали активатором G-белков мастопара-ном [Munnik et al., 1995], из чего следует, что в роли сигнального интермедиата между рецептором элиситора и фосфо-липазой Д выступает G-белок.
Различные изоформы фосфолипазы Д имеют отличающиеся оптимальные для проявления активности значения рН. Особый интерес представляет одна из основных изоформ, которая активируется повышающимися концентрациями ионов кальция (оптимальные значения для этой изоформы - от 20 до 100 мМ) и подкислением среды (оптимальные значения рН от 4,5 до 5,0), т.е. наиболее ранними изменениями в клетках, которые создаются на внутренней поверхности плазмалеммы и на внешней поверхности тоно-пласта при действии на клетки растений различных элиситоров. Для других изоформ оптимальными являются мик-
Время после механического
повреждения растения, ч
Рис. 11. Влияние механического повреждения листьев арабидоп-сиса на связывание фосфолипазы Д мембранами [X. Wang, 2000] 1 - фракция мембран (осадок после центрифугирования при 100 000 g надосадочной жидкости, полученной после центрифугирования гомогената листьев при 6000 g); 2 - фракция растворимых соединений, содержащихся в надосадочной жидкости после центрифугирования при 100 000 g. Проводился иммуноблоттинг фосфолипазы Д