ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 22.02.2019
Просмотров: 15245
Скачиваний: 17
150
Розділ 4
У 1964 р. японські дослідники Х. Нагазе і Т. Ніва запропонували заморожувати
сперму у вигляді гранул на блоках твердої вугільної кислоти. Методика виявилася пер-
спективною і у багатьох країнах, в тому числі й в Україні, з’явилися її удосконалення.
Сперма є специфічною біологічною рідиною. У процесі заморожування вона по-
винна пройти крізь зону субнормальних температур (20…0 °С), у якій можливий
температурний шок; зону низьких температур (від 0° до мінус 50°), – тут можлива
кристалізація внутрішньоклітинної води та осмотичні зрушення; зону дуже низьких
температур (від –50 до –196°), тобто тверду фазу, у якій хімічні реакції сповільнюють-
ся чи зупиняються, процеси старіння та переродження припиняються.
У процесі розморожування спермії також проходять ці зони, лише у зворотному
напрямку. При цьому у температурній зоні –196…–51 °C можлива рекристалізація,
а від –50 до 0 °С можливі осмотичні зрушення. Тому необхідними передумовами
успішного заморожування сперми є захист сперміїв від холодового удару під час охо-
лодження до 0 °С та захист сперміїв від кристалізації внутрішньоклітинної вологи
під час заморожування. Цього можна досягти при суворому дотриманні технології
розрідження, охолодження та заморожування і забезпеченні стабільної температури
у процесі зберігання. Припинення процесів старіння та переродження у замороженій
спермі дозволяє зберігати її безмежно довго. Після розморожування життєвість спер-
міїв, їх рухливість та запліднююча здатність поновлюються і введені у статеві шляхи
самки вони виконують свою біологічну місію.
Для захисту сперміїв від кристалізації води до складу розріджувача вводять кріопро-
тектори (гліцерин, лактозу, сахарозу чи рафінозу). Головним серед них є гліцерин. Це
ендоцелюлярний малотоксичний для сперміїв кріопротектор, який захищає їх від зне-
воднення протоплазми, кристалізації льоду, денатурації білка. Проте введення гліцерину
у середовище знижує його осмотичний тиск, а статеві клітини надзвичайно чутливі до
виникнення концентраційних градієнтів при переміщенні розчинених у їх протоплазмі
речовин у навколишнє середовище і навпаки. Тому для компенсації тиску вводять у се-
редовище також екзоцелюлярні кріопротектори (лактозу, сахарозу чи рафінозу).
Серед холодових агентів, що випробовувалися при заморожуванні сперми, слід
згадати сухий лід чи сніг (–78,9 °C), рідке повітря (–193,5…–183 °C, залежно від спів-
відношення азоту та кисню) його компоненти – рідкий азот (–195,8 °C), рідкий кисень
(–182,8 °C), рідкий водень (–252,8 °C) та рідкий гелій (–268,9…–272 °C) найпридатні-
шим виявився рідкий азот. Він не отруйний, хімічно інертний, не утворює вибухових
сумішей, не горить і не підтримує горіння, хоча, безумовно, при роботі з ним потрібно
дотримуватись певних передосторог.
Нині сперму бугаїв заморожують у формі не облицьованих чи облицьованих гранул,
у поліпропіленових соломинках, полістиролових піпетках, для цього опрацьовані від-
повідні рецепти середовищ та технологія заморожування. Вагомий внесок у цю справу
зробив Ф. І. Осташко з очолюваною ним школою дослідників. При одномоментному
розрідженні сперми за технологією Ф. І. Осташка через 5–10 хв. після її отримання в
неї вносять підігрітий до 30–35 °C розріджувач, що містить всі необхідні компонен-
ти, в тому числі кріопротектор. При двомоментному розрідженні перше середовище
Сперма. Фізіологія та біохімія сперми
151
вносять у сперму зра-
зу після її отримання,
а тоді через 5–10 хв.
проводять
додатко-
ве розрідження сере-
довищем № 2.
Розливають роз-
ріджену сперму у
флакони, закривають
їх стерильними гу-
мовими корками і ви-
тримують 4–6 годин
у холодильнику при
2–5 °C (еквілібрація).
Тоді приступають до
заморожування спер-
ми за тією чи іншою
технологією.
При
заморожу-
ванні сперми бугая
у вигляді гранул на
фторопластовій плас-
тинці у парі рідко-
го азоту занурюють
пластинку на 1 хв. у
рідкий азот (до при-
пинення кипіння азоту), тоді закріплюють її на висоті 2–3 см над поверхнею азоту і
за допомогою пластмасового шприца з голкою чи спеціальної крапельниці накрапу-
ють сперму у ямки (заглиблення) пластинки по 0,1–0,2 мл (при виготовленні малих
концентрованих гранул) чи 0,5–1,0 мл (для великих гранул). Витримують пластинку
зі спермою 2–3 хв. над рідким азотом, тоді занурюють її на 1–2 хв. у азот, виймають і
згортають гранули охолодженою лопаткою у марлеві мішечки чи контейнери і пере-
носять у посудину Дьюара на зберігання. Проте необлицьовані гранули незахищені
від мікробного забруднення.
Для одержання облицьованих гранул заповнюють розрідженою спермою поліети-
ленову трубку діаметром 3,8–4 мм, товщиною стінки 120 мкм, розділяють її за допо-
могою автоматичного приладу на окремі дози по 0,25–0,33 мл і загерметизовують їх,
охолоджують і заморожують. Потужність запропонованої Ф. І. Осташком технологіч-
ної лінії – 2 000 спермодоз за 1 годину (рис. 31).
У 1975 р. Касу (Франція) вперше застосував для фасування сперми бугаїв поліпро-
піленові соломинки (пайети) місткістю 0,5 мл. За цією технологією отриману сперму
Рис. 31. Схема технології асептичного взяття, консервування
та використання сперми бугаїв (за Ф. І. Осташком):
1 – механічне чучело, 2 – зібрана штучна вагіна, 3 – відділена частина спермоприй-
мача з еякулятом, 4 – визначення маси еякуляту, 5 – відділена чохол-пробірка з про-
бою сперми, 6 – штатив для фіксації спермоприймача, 7 – відбір проби для мікро-
скопування, 9 – пристрій для внесення розріджувача у спермоприймач-змішувач,
10 – перефасування розрідженої сперми в трубку, 11 – автомат ІУЖ для виготовлен-
ня облицьованих гранул, 12 – туба, 13 – пристрій для еквілібрації і заморожування
сперми, 14 – заморожування сперми, 15 і 16 – інструменти для осіменіння корів і
телиць.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
152
Розділ 4
розріджують середовищем “Леціфос–271” з додаванням 10 % курячого жовтка або се-
редовищем “Леціфос Пас–470”, розфасовують її під вакуумом у соломинки, кінці яких
герметизують полівініловим спиртом або запаюють зварювальним апаратом, марку-
ють, витримують 2 години у воді температурою 5 ºС і заморожують у парі азоту.
Згодом з’явилася технологія заморожування сперми у мініпайетах об’ємом
0,25 мл, яка дозволила заготовляти від бугая 30–40 тис. спермодоз за рік.
Довший час не вдавалося заморозити сперму кнура, що відзначається великим
об’ємом еякуляту, високою чутливістю сперміїв до низьких температур та особливос-
тями обміну речовин.
У 1972 р. німецькі дослідники Ріхтер та Лідіке повідомили про успішне замо-
рожування сперми кнура. Це надихнуло учених до подальших пошуків і незабаром
з’явилася белтсвільська технологія (США), яка, на жаль, виявилася громіздкою, дуже
неекономною (з одного еякуляту вдавалося отримати лише одну спермодозу) і тому
вона не знайшла практичного застосування.
В даний час у світі користуються чотирма методами заморожування сперми кну-
ра: американським (Pursel і Jonson), німецьким (Westendorf з співр.,1975), французь-
ким – INRA (Paquignon і Courot, 1976) та шведським (Larsson з співр.,1977). Ці мето-
дики передбачають еквілібрацію цілого еякуляту чи позбавлених плазми сперміїв при
15 °С; згущення сперми шляхом центрифугування і додавання невеликої кількості
розріджувача без гліцерину; додавання решти розріджувача і розрідження сперми до
концентрації 400–800 млн/мл та додавання гліцерину при температурі 5 °С; заморо-
жування сперми у вигляді гранул на сухому льоді або у соломинках над парою азоту;
зберігання сперми в рідкому азоті.
Схематично це собі можна уявити так (Almlid з співр.,1987):
♦ Фільтрування сперми.
♦ Розрідження трилоновим середовищем до об’єму 180–240 мл.
♦ Оцінювання концентрації рухливих сперміїв.
♦ Повільне охолодження до 15 °С.
♦ Центрифугування 10 хв. при 1900 об/хв.
♦ Розрідження (лактоза 11 % + жовток 20 %).
♦ Охолодження 1,5 години до 5 °С.
♦ Остаточне розрідження (лактоза+жовток+гліцерин 6 %+ паста Orvus 1,5 %).
♦ Наповнення соломинок (5 мл) спермою.
♦ Заморожування, 20 хв., 5 см над парою азоту.
♦ Зберігання у рідкому азоті.
Розморожування такої сперми проводять у водяній бані при температурі 50–52 °С
протягом 45–55 секунд.
У дозі сперми для осіменіння розмороженою спермою повинно бути 2–3 млрд
рухливих сперміїв.
Не менш складною виявилася проблема заморожування сперми барана. Справа у
тому, що у спермі барана немає природного антиоксиданту, що захищав би спермії від
Сперма. Фізіологія та біохімія сперми
153
супероксиду О
2
Н, що утворюється
у процесі метаболізму сперміїв і є
досить активним окислювачем.
При заморожуванні сперми
відбувається перекисне окислення
ліпідів, яке руйнує білково-ліпідні
комплекси у мембранах спермі-
їв і пошкоджує акрозому. Вклю-
чення до складу середовища для
сперми барана антиоксидантів
(ехінохром, коламін, токоферол,
ІХФГАН–3) не лише попереджує
кріогенні пошкодження, але й під-
вищує стійкість сперміїв до хо-
лодового удару. На цій основі були запропоновані середовища для заморожування
сперми барана – жовтково-сахарозо-хелатоно-гліцеринове з токоферолом (чи ехіно-
хромом), лактозо-гуміарабік-тріс-цитратне та інші, розроблені відповідні технології
заморожування.
Сперму жеребця для заморожування розріджують лактозо-хелато-цитратно-жовт-
ковим середовищем у 5 разів, розфасовують у поліпропіленові трубки місткістю
10 мл, охолоджують і заморожують.
Існує два підходи до заморожування сперми жеребця. Перший з них базується
на розрідженні сперми, отриманої на “закриту штучну вагіну”, “згущенні” сперміїв
шляхом центрифугування з видаленням рідкої частини, додатковому розрідженні їх
до бажаної концентрації, одногодинній еквілібрації при +4 °С і заморожуванні в со-
ломинках ємністю 4 мл чи 0,5–1 мл або ж у скляних ампулах місткістю 1 мл.
Соломинки зі спермою перед заморожуванням поміщають в охолоджені мідні
трубки, які занурюють на 7 хв. у рідкий азот і переносять у посудину Дьюара.
Другий підхід передбачає заморожування лише фракції, багатої сперміями, отри-
маної за допомогою “відкритої штучної вагіни” і заморожування її в алюмінієвих ту-
бах, що використовуються в косметиці для зубних паст (Bielanski, Tischner, 1979).
Для розморожування сперми, замороженої у вигляді соломинок, поміщають одну
дозу сперми (8 соломинок) у водяну баню з температурою 37 °С на 30 сек. і після роз-
мороження додають до неї 16 мл розріджувача (без гліцерину), підігрітого до 37 °С.
При використанні для заморожування сперми жеребця великих соломинок – після
розморожування у них сперми можна їх використовувати безпосередньо для осіме-
ніння кобил, з’єднавши соломинку з піпеткою для введення сперми.
Найкращі наслідки осіменіння отримують при проведенні його 12 годин до чи
6 год після овуляції.
Для перевезення сперми у рідкому азоті (–196 °C) користуються спеціальними чи
алюмінієвими двостінними посудинами з вакуумно-порошковою або багатошарово-
Рис. 32. Посудини Дьюара для стаціонарного збе-
рігання сперми: зліва – посудина КВ-6202, решта –
посудина АТ-7, “Харків-30”, СД-50, СД-20 та АТ-6.
154
Розділ 4
вакуумною ізоляцією, місткістю від 4 до 50 л рідкого азоту (АТ–6, СДС–20, “Хар-
ків–30”, “Харків–34А”).
Зберігають сперму у племпідприємствах і філіях у спеціальних сховищах чи схо-
вищах типу ХБ–0,5, КВ–6202 та ін. (рис. 32).
Для розморожування замороженої в формі гранул сперми переносять її за допо-
могою охолодженого пінцета у флакон з 1 мл 2,9 %-го розчину цитрату натрію, попе-
редньо підігрітого у водяній бані при температурі 40–42 °C. Через 8–10 сек. виймають
флакон зі спермою з водяної бані, оцінюють якість сперми і при рухливості сперміїв
не нижче 4 балів сперму використовують для осіменіння.
Розморожування сперми у відкритих гранулах можна проводити і без викорис-
тання 2,9 %-го розчину натрію цитрату. Для цього опускають гранулу у тонкостінну
стерильну пробірку з випуклим дном, підігріту попередньо 4–5 хв. у водяному тер-
мостаті до 38±0,5 ºС, і після повного розморожування гранули набирають сперму у
піпетку для осіменіння.
Розморожування сперми, замороженої у капілярах (пайетах) проводять у водя-
ній бані з дистильованою водою чи розчином фурациліну (1 : 5000) при температурі
38–40 °С, поміщаючи в неї капіляр корком донизу у поліетиленовому мішечку. Потім
пайету виймають, протирають марлевою серветкою, відрізають стерильними ножи-
цями загерметизований кінець, перевіряють якість сперми і вставляють в інструмент
для осіменіння.
Можна проводити і прискорене двоступінчасте розморожування за допомогою
приладу УДС–1.
Відтавання облицьованих гранул також проводять протягом 8–10 сек. у водяній бані
з дистильованою водою чи розчином фурациліну (1 : 5000) при температурі 38–40 °С.
Розморожені гранули витирають стерильною серветкою, розрізають ножицями, пере-
віряють під мікроскопом і при позитивній оцінці використовують для осіменіння.
Заморожену у вигляді гранул сперму барана розморожують таким чином: засипа-
ють у розігрітий водяний чи електричний відтаювач одночасно до 20 гранул і дають
можливість стекти розмороженій спермі у стерильний флакон.
Алюмінієві пакети із замороженою спермою жеребця занурюють за допомогою
пінцету у водяну баню і легко похитують.
Заморожену у вигляді гранул сперму жеребця насипають одним шаром у стериль-
ну конічну колбу і занурюють її у водяну баню.
При роботі з замороженою спермою та рідким азотом необхідно суворо дотриму-
ватись техніки безпеки. Перш за все, техніки-оператори повинні працювати з рідким
азотом у захисних окулярах та шкіряних рукавицях. Оголені ділянки тіла потрібно
надійно захищати одягом.
Посудини Дьюара із замороженою спермою необхідно зберігати у добре вентильо-
ваному приміщенні біля вікна, щоб можна було доливати рідкий азот через кватирку. За
півгодини до роботи приміщення вентилюють. Заповнюють порожні посудини Дьюа-
ра рідким азотом поступово, через гнучкий шланг, опустивши його наконечник до дна
посудини. Ні в якому разі при цьому не можна заглядати у горловину посудини.