ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 22.02.2019
Просмотров: 14895
Скачиваний: 16
Сперма. Фізіологія та біохімія сперми
145
Перед використанням яєць їх миють щіткою, витирають марлевою серветкою і
протирають спиртовим тампоном або ж опромінюють бактерицидними лампами (на
шкаралупі яйця виявлено 13 видів мікроорганізмів та 7 видів пліснявих грибів).
Молоко для виготовлення молочних розріджувачів повинно бути свіжим, від здо-
рових корів. Можна також використовувати сухе напівжирне молоко.
Дистильована вода має бути чистою, прозорою, без слідів металу. Для окислення
летких органічних речовин до води, що піддається дистиляції, додають марганцево-
кислий калій до червоного забарвлення.
Готують розріджувачі у скляній посудині і безпосередньо перед одержанням спер-
ми з таким розрахунком, щоб від моменту його виготовлення і до застосування про-
йшло не більше 1–2 годин.
Розріджувати сперму слід не пізніше, як через 10–15 хв. після її отримання.
Перед розрідженням сперми обов’язково визначають у ній концентрацію та рух-
ливість сперміїв і на підставі цих даних визначають ступінь розрідження, тобто відно-
шення об’єму середовища, котре додається на кожен мілілітр еякуляту, що має певні
межі. Граничний ступінь розрідження можна визначити за формулою:
С
р
= 1 : (С × Р
е
× Р
о
× 0,01× О
д:
КС
ппр
× 1,2–1),
Ср – граничний ступінь розрідження;
С – концентрація сперміїв у розріджуваному еякуляті, млрд/ мл;
Р
е
– рухливість сперміїв у еякуляті, бали;
Р
о
– мінімально допустиме розрідження сперміїв перед осіменінням, бали;
0,01 – коефіцієнт поправки на рухливість сперміїв;
О
д
– об’єм дози розрідженої сперми, мл;
КС
ппр
– мінімальна кількість сперміїв з прямолінійно-поступальним рухом у
дозі, млрд;
1,2 – коефіцієнт поправки на КС
ппр
.
Сперму бугая, барана спочатку розріджують 1 : 1 або 1 : 2 у спермоприймачі, а
тоді переливають її у чистий, стерильний, підігрітий до 40 ºС градуйований змішувач
чи мензурку і поступово доливають решту середовища. Температура розріджувача
повинна відповідати температурі сперми. Якщо час між отриманням двох еякулятів
складає більше 20 хвилин (а сперму отримують дуплетною садкою), то до розріджен-
ня еякуляту в нього додають 5–10 % жовтка (1–2 краплі на 1 мл сперми). Середовища,
що містять гліцерин, краще додавати до сперми двомоментно: спочатку 0,5 : 1, а через
15–20 хв. повторно, до потрібного розрідження. Щоб переконатися, що розрідження
не погіршило якості сперми, зразу після змішування її з середовищем перевіряють
активність сперміїв. Якщо вона знизилась – розріджувач виготовлений не вірно. У та-
ких випадках готують новий розріджувач. Розрідження сперми проводять у стериль-
них умовах у камері УНБК–1 або в лабораторії, обладнаній бактерицидними лампами
БУВ–30.
146
Розділ 4
Ступінь розрідження встановлюють залежно від концентрації і активності спер-
міїв. Допускається до розрідження сперма бугая та барана з активністю не нижче 8
балів, кнура – 7, жеребця – не нижче 5 балів, при концентрації сперміїв у бугая не
менше 0,7, барана – 1,0, кнура і жеребця – 0,15 млрд на мл.
Сперму бугая можна розріджувати в 10–32 рази, сперму барана у 2–3 рази, жереб-
ця і кнура – 2–5 раз. Найвищі ступені розрідження застосовують, отже, до сперми бу-
гая. При потребі цей ступінь розрідження можна збільшити, довівши його до 1 : 100,
а то й до 1 : 200. У дозі розрідженої сперми має бути 15–25 млн рухливих сперміїв.
Використовувані на станції середовища повинні періодично піддаватися біокон-
тролю, особливо, коли переходять на застосування нових рецептів середовищ або ж
нових серій реактивів і антибіотиків; контроль середовищ проводять за методикою
визначення абсолютного і відносного показника живучості сперміїв. При цьому вста-
новлюють оптимум та максимум розрідження.
Оптимум розрідження – це такий ступінь розрідження, при якому досягають най-
вищої живучості сперміїв.
Максимум розрідження – найбільший ступінь розрідження, при якому живучість
сперміїв не падає нижче їх живучості у нерозрідженій спермі.
Чинними інструкціями, постановами та методичними вказівками з штучного осіме-
ніння рекомендовані варіанти середовищ для усіх видів сыльськогосподарських тварин
для зберігання сперми при 2–5 °C, кімнатних температурах та у замороженому вигляді.
Для розрідження та короткочасного зберігання сперми бугая при 2–5 °C застосо-
вують глюкозо-цитратно-жовткове середовище.
Для розрідження та заморожування сперми бугая у формі гранул користуються
лактозо-жовтково-гліцериновим, а для облицьованих гранул – лактозо-фруктозо-ра-
фінозо-магнієво-гліцерино-жовтковим середовищем.
Найширше розповсюдження при розрідженні сперми барана отримав глюкозо-
жовтково-цитратний розріджувач. Останнім часом акцент переноситься на глюкозо-
фосфатне середовище.
При зберіганні сперми кнура у жовткових розріджувачах наштовхнулися на пере-
шкоди, обумовлені наявністю у плазмі сперми фосфоліпази А, що є у секреті цибу-
линно-сечівниковох залоз. Цей ензим гідролізує лецитин жовтка до жирних кислот і
лізолецитину, які токсичні для сперміїв і викликають коагуляцію розріджувача. Ток-
сичний ефект можна частково зменшити, видаляючи плазму сперми, або хірургічно
видаляючи у кнура ці залози.
Із численних середовищ для розрідження сперми кнура при температурі 16–20 °С
найбільше розповсюдження отримали глюкозо-хелато-цитратні.
При фракційному методі осіменіння свиней застосовують розріджувачі-заповню-
вачі (сольовий, цукровий, молочний).
Для розрідження сперми жеребця частіше всього застосовують глюкозо-жовткове,
молочно-жовткове і лактозо-жовткове середовища. У тих випадках, коли осіменіння
кобил проводять свіжоодержаною спермою, можна використовувати глюкозне чи цу-
крове середовища.
Сперма. Фізіологія та біохімія сперми
147
Зберігання сперми. Штучне осіменіння сільськогосподарських тварин нині про-
водиться переважно збереженою спермою. Отже, ефективність використання цього
методу залежить, в першу чергу, від тривалості виживання сперміїв у спермі, що збе-
рігається. Як уже підкреслювалося, воно залежить як від енергетичних запасів спер-
ми, так і від інтенсивності їх використання.
Розробляючи методи зберігання сперми, вчені виходили з наявності у природі двох
станів живих організмів: життєдіяльного та нежиттєдіяльного (А. М. Голдовський). У
життєдіяльному стані істота може проявляти повну активність (біоз) чи дещо упо-
вільнену активність (гіпобіоз); у нежиттєдіяльному стані вона може перебувати в ана-
біозі (тобто не проявляючи функції життєдіяльності), або ж у мезабіозі (проявляючи
лише процеси дисиміляції, тобто розпаду речовин клітини).
Звичайно метою зберігання живих об’єктів є переведення їх у нежиттєдіяльний
стан, коли життєспроможні структури не ушкоджуються, енергетичні запаси не витра-
чаються, а їхня функція, при певних умовах, може бути відновлена (Ф. І. Осташко).
Для збільшення виживання сперміїв поза організмом необхідно знизити у них ак-
тивність обмінних процесів, загальмувати їх рухливість і розрідити секрети додатко-
вих статевих залоз розчинами, що не активують рухливості сперміїв та не руйнують
їх ліпопротеїдного покриву. Цього можна досягти шляхом застосування відповідних
розріджувачів, зниження температури сперми, створення у ній анаеробних умов, вне-
сення у розріджувачі метаболічних інгібіторів (органічні кислоти, хелатон та ін.) і
зниження за рахунок цього рухливості сперміїв.
Зберігати можна лише сперму доброї якості. При виборі способу зберігання спер-
ми виходять з її видових особливостей. Сперма тварин з піхвовим типом природно-
го осіменіння відрізняється вищою живучістю сперміїв поза організмом самця, ніж
сперма тварин з матковим типом осіменіння. При будь-якому методі зберігання необ-
хідно перевести спермії у стан анабіозу. Найширше для цього застосовують холод,
не допускаючи швидкого охолодження, яке може призвести до загибелі сперміїв від
холодового удару.
У практиці тваринництва нині користуються короткотривалим зберіганням спер-
ми при температурі 2–5 °C (бугаїв – до 72 год., баранів – до 24 год., жеребців –до
48 год.), короткотривалим зберіганням при температурі 16–20 °C (кнурів – до 72 год.)
і тривалого зберігання – у парі рідкого азоту при –196 °С.
Короткочасне зберігання сперми при температурі танення льоду (2–5 °С). Цей
метод досить простий, доступний, він зіграв велику роль у широкому розповсюджен-
ні штучного осіменіння. Після розрідження і півгодинного витримування сперми при
кімнатній температурі, її розфасовують у флакони (ампули, пробірки і т. п.) і ставлять
на зберігання у холодильник при температурі 4 °С чи у термос з льодом. У першому
випадку флакони зі спермою обгортають шаром вати, поміщають у поліетиленові мі-
шечки і ставлять у кювету з льодом, додаючи туди трохи холодної води, і поміщають
на полицю холодильника, де температура підтримується у межах 2–5 °С. Якщо ж для
зберігання сперми користуються широкогорлим харчовим термосом, то його попе-
148
Розділ 4
редньо заповнюють наполовину об’єму дрібними кусками чистого промитого у воді
льоду з температурою 0 °С. Якщо температура льоду нижче нуля (не видно танення),
то після промивання водою дають йому постояти у теплому приміщенні, поки не по-
чне танути.
Зверху льоду кладуть кружок поліетиленової плівки, тоді шар сірої вати, товщи-
ною 0,5 см, а тоді ставлять зверху вертикально чи похило флакони зі спермою. Через
3–4 години шар вати видаляють і ставлять флакони безпосередньо на лід. У такій
спермі дихання та фруктоліз сперміїв гальмується у 2–25 разів (М. П. Шергін). Проте
сперма окремих бугаїв погано переносить охолодження.
Зберігання сперми при кімнатній температурі. Ще у 1924 р. К. Н. Кржижковсь-
кий та Г. Н. Павлов встановили, що виділювана під час дихання сперміїв СО
2
, всту-
паючи в реакцію з водою, утворює вугільну кислоту, яка легко проникає крізь обо-
лонку сперміїв і гальмує у них обмін речовин. На цій підставі Ван Демарк і Шарма у
1957 р. запропонували розріджувач ІВТ (іллінойський для варіюючих температур). У
розрідженій ним спермі після насичення її вуглекислим газом до рН 6,2–6,4 спермії
зберігали свою живучість при кімнатній температурі до 5–7 днів. В. К. Милованов
та М. В. Ситіна запропонували бікарбонатно-фосфатний розріджувач, у якому СО
2
утворювалася безпосередньо у розрідженій спермі внаслідок взаємодії між гідрокар-
бонатом натрію і однозаміщеним фосфатом калію:
NaHCO
3
+ KH
2
PO
4
= NaKHPO
4
+ H
2
CO
3
Дослідники Корнельського університету (Фут, Янг, Данн) запропонували в 1958 р.
своє середовище, головним інгібітором рухливості сперміїв у якому була лимонна кис-
лота, а Кок в Нідерландах використав з цією метою хелатон (трилон Б, ЕДТА – етилен-
діамінтетраоцтова кислота). Це започаткувало серію середовищ для зберігання сперми
при кімнатній температурі, до складу яких входять органічні кислоти (аскорбінова, са-
ліцилова, винна, янтарна, яблучна та ін.) чи хелатон. Розріджену таким середовищем
сперму розфасовують у щільно закупорювані флакони чи запаювані ампули і зберіга-
ють у коробці з добрим теплоізолюючим матеріалом чи термосі з льодом, що тане.
Сперму кнура, розріджену хелатоновим середовищем (за М. Т. Плішко), зберіга-
ють у термосі, заповненому на 1/4 льодом, поверх якого кладуть поліетиленову плів-
ку, а на неї – шар вати товщиною 1–1,5 см.
Колби чи флакони з розрідженою спермою закривають (не герметично) плівкою
або пергаментним папером і ставлять поверх вати у термосі. Сперму жеребця збері-
гають у термосі в простерилізованих скляних банках місткістю 100 мл з притертими
корками або в спеціальних скляних ампулах місткістю 30 мл, що закриваються гумо-
вими корками; їх поміщають у двошарові ватно-марлеві мішечки і повільно охоло-
джують у термосі.
Наявний у складі розріджувача хелатон при кімнатній температурі інактивує фер-
менти і пригнічує обмін речовин у сперміїв. При підігріванні сперми до температури
тіла (у геніталіях осімененої самки) поновлюється рухливість сперміїв.
Сперма. Фізіологія та біохімія сперми
149
Тривале зберігання сперми при низьких температурах є найбільшим досягненням
у галузі штучного осіменіння другої половини ХХ сторіччя. Короткочасне зберігання
сперми при 2–5 °C та при кімнатній температурі має істотні недоліки: короткотрива-
лість, великі транспортні витрати (необхідно щодня чи через день доставляти сперму
на пункти), неповне використання сперми на пунктах, велике навантаження і нерівно-
мірне використання плідників. Ці недоліки відпадають при зберіганні сперми у гли-
боко замороженому стані. Воно дозволяє рівномірно використовувати протягом року
плідників, повністю використовувати сперму на пунктах і створювати її запаси (банки
сперми) на племпідприємствах; створюються необмежені можливості для племінної
роботи, оскільки сперма тепер може транспортуватися на безмежні віддалі, включа-
ючи й міжнародну торгівлю; її можна зберігати десятки років; спрощується й оцінка
плідників за якістю нащадків.
Проблема біологічної дії холоду на спермії бере свій початок з досліджень Спалан-
цані (1787), Монтегаца (1866), І. І. Іванова (1907), К. Н. Кржижковського та Г. Н. Пав-
лова (1922). Було встановлено, що тривале зберігання гамет можливе лише в умовах
повного анабіозу, при якому гальмуються всі біохімічні процеси.
Сперма – це біологічна рідина, у якій зважені клітини (спермії). При повільному
її заморожуванні наступає кристалізація води. Її можна уникнути при надшвидкому
заморожуванні (вітрифікація) з швидкістю 5 тис. градусів за секунду.
При вивченні явища анабіозу у рослинних та тваринних клітин П. Г. Бахметьєв
(1902) прийшов до висновку, що однією з причин їх загибелі є втрата води їх прото-
плазмою при охолодженні. Академік Максимов (1913) довів, що додавання до замо-
рожуваних рослинних клітин гліцерину захищає їх від обезводжування протоплазми,
денатурації білка, кристалізації льоду. Згодом це підтвердили на сперміях А. Д. Бер-
нштейн та В. В. Петропавловський (1936), які вивчали зміни живучості сперміїв при
їх охолодженні до –15…–23 °C. Проте цей факт не був критично оцінений і викорис-
таний. Дещо пізніше Янель (1938) встановив, що спермії чоловіка володіють надто
високою стійкістю до охолодження у рідкому азоті (мінус 196 ºС) і навіть у рідкому
гелії (мінус 269 ºС).
У 1948 р. І. В. Смирнов вперше заморозив нерозріджену сперму жеребця, кроля,
бугая та барана у пакетиках з алюмінієвої фольги на поверхні твердого двоокису вуг-
лецю (мінус 79 °C) та у парі рідкого кисню, але більша частина сперміїв при цьому
гинула. Внаслідок багаторазового осіменіння овець та корів такою спермою автор
отримав у 1950–1951 рр. ягнят та телят. Цю роботу було визнано відкриттям.
У 1948 році група англійських біологів з Кембріджського університету на чолі
з С. Полджем, опрацьовуючи технологію заморожування сперми півня, випадко-
во виявили захисні властивості гліцерину і запропонували у 1952 році технологію
заморожування сперми бугая з його використанням. Технологія виявилася склад-
ною – спочатку сперму розріджували, охолоджували 4 години до 5 ºС, повторно роз-
ріджували охолодженим середовищем з вмістом 20 % гліцерину, знову витримували
12–18 годин при 5 ºС, розфасовували у скляні ампули і заморожували у ступінчас-
тому режимі.