ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 22.02.2019
Просмотров: 14892
Скачиваний: 16
140
Розділ 4
Проте ні один із застосовуваних у даний час методів не відповідає головній вимозі:
дати швидку відповідь про запліднюючу здатність сперміїв;
не бути громіздким;
тісно корелювати з фактичною запліднюваністю самок.
Визначити точно запліднюючу здатність сперміїв, навіть стосовно певної групи
самок, що перебувають у контрольованих умовах утримання, догляду та осіменін-
ня, наявними клінічними методами важко тому, що на цей показник впливає багато
факторів.
Одні автори вважають, що запліднююча здатність сперміїв становить 70–75 % від
першого осіменіння, інші доводять, що у клінічно здорових корів при повноцінному
статевому циклі вона становить не менше 90 %, лише у значної частини тварин буває
рання ембріональна смертність.
У зв’язку з цим у практиці тваринництва запліднюючу здатність сперміїв оціню-
ють за кількістю корів, які не прийшли повторно в охоту через 18–22 та 60–90 днів
після осіменіння, а також ректальним дослідженням на тільність. Але в таких ви-
падках важко віддиференціювати потенціальні здатності самців від запліднюваності
самок. Тобто, на плодючість бугаїв нашаровується здатність корів до запліднення.
4.3. Розрідження і зберігання сперми
Розрідження (розбавлення) сперми. Спермії, які утворюються у звивистих ка-
наликах сім’яників самців, скупчуються у придатках сім’яників, де можуть зберігати
тривалий час свою життєвість у стані анабіозу. Цьому сприяє високий вміст тут йонів
водню, калію та вугільної кислоти, низька концентрація кисню, гліколізованих цу-
крів, інтенсивне видалення з током крові продуктів обміну та знижена температура у
порожнині калитки.
Під час еякуляції спермії змішуються з секретами додаткових статевих залоз, ви-
ходять зі стану анабіозу і починають енергійно рухатися. Це приводить до швидкого
витрачання поживних речовин і нагромадження шкідливих продуктів обміну. Наявні
у секретах додаткових статевих залоз хлористі солі натрію та калію сприяють на-
буханню та сповзанню ліпопротеїдного покриву сперміїв, зниженню, а то й втраті
ними електричного заряду, що врешті обумовлює спочатку зірчасту їх аглютинацію
(склеювання голівками), а потім – масову коагуляцію. Крім того, нерозріджена спер-
ма чутлива до різких коливань температури. Нарешті, у процесі еякуляції сперма за-
бруднюється мікроорганізмами, які негативно впливають на живучість та заплідню-
ючу здатність сперміїв.
Проведені ще у тридцятих роках ХХ ст. дослідження показали, що виживання
сперміїв поза організмом можна збільшити шляхом сповільнення їх рухливості, зни-
ження інтенсивності у них обмінних процесів, ослаблення несприятливої дії на спер-
мії секретів додаткових статевих залоз і мікроорганізмів.
Досягти цього можна шляхом розрідження сперми та відповідного режиму її
зберігання.
Сперма. Фізіологія та біохімія сперми
141
При розрідженні сперми переслідують таку мету: зменшити концентрацію у спер-
мі та ослабити несприятливу дію на спермії шкідливих речовин; створити середови-
ще, яке захищає спермії від холодового удару та мікробного забруднення; збільши-
ти об’єм використовуваної сперми і за рахунок цього – інтенсивність використання
плідників; створити оптимальні умови для виживання та зберігання запліднюючої
здатності сперміїв на більш тривалий час.
Виходячи з цього, розріджувач повинен відповідати таким вимогам:
бути ізотонічним зі сперміями даного виду тварин і підтримувати нормальний
осмотичний тиск протягом усього періоду зберігання;
мати достатню буферну ємність за кислотним та лужним показниками;
мати оптимальну електропровідність;
нейтралізувати шкідливу дію на спермії плазми сперми і продуктів метаболіз-
му сперміїв;
забезпечувати спермії джерелами енергії для їх виживання в аеробних та ана-
еробних умовах;
захищати спермії від холодового удару та негативного впливу мікрофлори;
мати нейтральну або близьку до неї концентрацію водневих йонів (не нижче 6,2
і не вище 7), залежно від призначення середовища, і оптимальний осмотичний тиск;
максимально зберігати запліднюючу здатність сперміїв.
У кінці XIX ст. І. І. Іванов вперше застосував ізотонічні розчини натрію хлориду,
натрію бікарбонату та рідину Лока для розрідження сперми при осіменінні кролів,
морських свинок, собак, а пізніше й корів та кобил. При цьому було відмічено над-
звичайно високе пристосування сперміїв до навколишнього середовища. Вони добре
зберігали рухливість у ізотонічних розчинах хлористого натрію, калію, барію, маг-
нію, вуглекислого та двовуглекислого калію і навіть у розчинах дифтерійного токси-
ну, антитоксину та антидифтерійної сироватки.
Проте згодом виявилося, що у чистих фізіологічних розчинах хлориду натрію та
інших нейтральних солей спермії виживають гірше, ніж у їх сумішах.
У 1928 році в Японії Ямане і Като запропонували для розрідження сперми же-
ребця і кроля суміш 5 %-го розчину глюкози з фосфатним буфером (рН 7,2–7,4), в
якій вдалося збільшити виживання сперміїв жеребця до 116 годин. У 1929–1930 рр.
В. К. Милованов зі співробітниками запропонували рецепти цього розріджувача для
сперми різних видів сільськогосподарських тварин.
Однак одного розрідження, як виявилося згодом, недостатньо для збільшення ви-
живання сперміїв. Як відмітив ще в свій час Л. Спалланцані, збільшити виживання
сперміїв можна, застосовуючи, поряд з розрідженням, охолодження сперми. Про-
те при швидкому охолодженні у сперміїв наступає температурний шок (холодовий
удар). К. Н. Кржишковський, Г. Н. Павлов (1927), В. К. Милованов та І. А. Селівано-
ва (1932) встановили, що захистити спермії від холодового удару можна за допомо-
гою фосфоліпідів, а Філліпс і Ларді у США, враховуючи високий вміст фосфоліпідів
(лецитину) у жовтку курячого яйця, включили його до складу розріджувача.
142
Розділ 4
М. П. Павленко та Л. М. Павленко екстрагували з жовтка термостабільний анти-
шоковий компонент, застосування якого у 3 %-й концентрації дає такий же ефект, як
30 %-й жовток.
У 1941 році Г. Солсбері, Х. Фаллер і Е. Віллет, враховуючи кращу розчинність
жирових кульок жовтка у цитраті натрію, ніж у фосфаті, запропонували жовтково-ци-
тратний розріджувач. Широкого розповсюдження у п’ятдесятих роках в СРСР набув
глюкозо-цитратно-жовтковий розріджувач, запропонований Б. Д. Раднабазароном, до
складу якого входять глюкоза, цитрат натрію та жовток курячого яйця.
Склад розріджувача повинен відповідати особливостям сперми того виду тварин,
для якого він призначений. Так, у густій спермі бугая та барана швидко накопичується
молочна кислота та інші продукти обміну. Для їх нейтралізації, зменшення проник-
ності оболонки сперміїв, сповільнення набухання колоїдів цитоплазми розріджувач
повинен містити такі буфери, як цитрат чи фосфат натрію з рН 7,8–8,0.
Заслуговують на увагу дослідження М. П. Шергіна, який у 1945 році встановив,
що сперма бугая, розріджена молоком, краще виживає, ніж у 1 %-му розчині хло-
ристого натрію; молоко виявилося фізіологічним середовищем для сперміїв. На цій
підставі Н. Н. Михайлов запропонував молочні розріджувачі для сперми жеребця та
бугая, а Г. В. Звєрєва та Б. М. Чухрій – розріджувач із сухого молока.
Слід відмітити, що некип’ячене молоко шкідливе для сперміїв, що зв’язують з
альбуміновою фракцією білка, яка лише при кип’ятінні піддається змінам.
Таким чином, для розрідження сперми використовують як синтетичні, так і біоло-
гічні середовища. Склад середовища залежить від того, для якого виду тварин та для
якого режиму зберігання воно призначене. Для зберігання сперми при 2–5 °C широко
застосовуються жовткові середовища.
Розріджувачі, що використовуються для зберігання сперми у замороженому ви-
гляді, містять у своєму складі кріопротектори (гліцерин, етиленгліколь, поліетиленок-
сид, рафінозу та ін.).
Для пригнічення мікрофлори до складу розріджувачів додають сануючі речовини:
білий стрептоцид, пеніцилін кристалічний (натрієва або калієва сіль) та стрептомі-
цин сірчанокислий або солянокислий, або суміш цих препаратів під назвою “Спер-
мосан – 3”.
У багатьох країнах були запропоновані сухі синтетичні препарати (семінал і нео-
семінал, спермозол, лаціфос, капроген та ін.), які перед використанням розріджують
у певному об’ємі дистильованої води.
Компоненти розріджувача проявляють різноманітний вплив на спермії; неелек-
троліти (моно- і поліцукри) підтримують у розчинах осмотичний тиск, проявляють
захисну дію під час заморожування, інактивують антитіла, зменшують електропровід-
ність сперми, сприяють збереженню електричного заряду сперміїв, перешкоджають їх
аглютинації; глюкоза та фруктоза можуть служити джерелом енергії; амінокислоти у
розчинах створюють осмотичний тиск, виконують роль амфотерного буфера. Окремі
Сперма. Фізіологія та біохімія сперми
143
лужні та амфотерні водорозчинні амінокислоти виконують захисну функцію, знижу-
ють активність ферментів та інтенсивність обмінних процесів у сперміях; зв’язуючи
кисень та перекис водню, амінокислоти можуть виконувати роль антиоксидантів.
Проте неелектроліти слабо захищають спермії від холодового удару, не забезпечу-
ють буферності та електропровідності середовища.
Електроліти (цитрат натрію, тартрат, бікарбонат натрію, сульфат амонію та ін.)
захищають оболонку сперміїв від набухання і знижують її проникність, позитивно
впливають на обмін речовин, нейтралізують шкідливу дію токсичних продуктів об-
міну, частково захищають спермії від температурного шоку; електроліти утворюють у
середовищах буферну ємність, електропровідність, створюють рН розчину.
Речовини, що утворюють електролітну основу, складаються з аніонів та катіонів.
Аніони проявляють сильнішу дію на зберігання сперміїв, ніж катіони. Чим вища валент-
ність аніонів, тим краще виживання у їх розчинах сперміїв. Наприклад, хелатон (чоти-
ривалентні аніони) проявляє найсильнішу дію на окисно-відновні процеси у сперміях.
Будучи сильним комплексоном, він тимчасово зв’язує іони металів кальцію і магнію,
гальмує активність протеаз, аденозинтрифосфатаз, фосфофруктокінази, гексодифосфа-
тази та інших ферментів, знижує обмінні процеси у сперміях. Крім того, він володіє
високими буферними властивостями і гальмує розвиток мікроорганізмів у спермі.
Жовток захищає спермії від холодового удару, при температурі нижче 16 ºС під-
вищує стійкість клітин проти дії токсичних речовин, гіпо- і гіпертонічних розчинів,
світла та інших факторів зовнішнього середовища. Проте при швидкому охолоджені
сперми, розрідженої цукрово-жовтковими середовищами, можливий шок.
Серед кріопротекторів у середовищах для заморожування сперми (гліцерин,
етиленглікольполіетиленоксид, рафіноза та ін.) найвищими захисними властивостя-
ми при заморожуванні володіє гліцерин. Він затримує початок кристалізації води і
сповільнює ріст кристалів, знижує осмотичний тиск розчинених речовин при замо-
рожуванні до евтектичної точки (–46,5 ºС). Гліцерин завжди знаходиться у фазі роз-
чину, внаслідок чого концентрація осмотично активних речовин зменшується, що
сприяє зберіганню клітин. Проте гліцерин не індиферентна речовина по відношенню
до сперміїв. Вже при концентрації 3,5 % він проявляє сильну гіпотонічну дію. При
зменшенні концентрації гліцерину у середовищі зменшується його захисна дія, а при
збільшенні концентрації і часу контакту при плюсовій температурі він проявляє руй-
нівний вплив на структуру сперміїв.
Сануючі речовини (антибіотики, сульфаніламіди та хіміотерапевтичні препарати,
спермосан – 3 та ін.) поряд з пригніченням росту мікроорганізмів дещо знижують об-
мінні процеси сперміїв, тому не можна ними зловживати.
Нативна сперма володіє певними бактерицидними властивостями, у ній виявлено
білок семіналплазмін, що проявляє на мікрофлору дію, адекватну пеніциліну, стреп-
томіцину чи тетрацикліну. Проте, при розрідженні сперми, особливо сильному, зни-
жується його захисний вплив. Застосовувані сануючі засоби не завжди дають бажа-
144
Розділ 4
ний ефект, до того ж вони не припиняють розмноження мікроорганізмів і негативно
впливають на обмін речовин у сперміях (В. А. Яблонський, 1962).
Склад середовища залежить не лише від видових особливостей сперми, але й
технології її зберігання. Наприклад, при плюсовій температурі зберігання кращі на-
слідки отримують при поєднанні у середовищах електролітів та неелектролітів, при
заморожуванні сперми у гранулах – перевагу віддають неелектролітам.
Зберігати сперму бугаїв при кімнатній температурі вдалося лише після розроб-
ки зворотного кислотного інактивування сперміїв за допомогою слабких органічних
кислот, насичення розріджувача вуглекислим газом. Проте нестійка вугільна та інші
слабкі кислоти швидко розкладаються, двоокис вуглецю вивітрюється і тому згодом
перейшли на нелеткі жирні кислоти: лимонну, аскорбінову, саліцилову, борну, щаве-
леву, винну, яблучну, янтарну, капронову та ін. Значно ефективнішим виявився пре-
парат, що пригнічує обмінні процеси у спермі – двонатрієва сіль етилендиамінтетра-
оцтової кислоти (синоніми – ЕДТА, хелатон, трилон Б, селектор). Блокуючи обмінні
процеси у сперміях, він збільшує їх виживання.
Розроблене М. Т. Плішком на основі хелатону глюкозо–хелато–цитратне сере-
довище широко застосовується для зберігання сперми кнура при 16–20 °C.
При вірному підборі компонентів розріджувача одні з них можуть підсилювати
дію інших. Наприклад, дію хелатону можуть підсилювати аргінін, глікокол та інші
водорозчинні амінокислоти; дію лактози та ряду інших цукрів при плюсових темпе-
ратурах зберігання підсилюють додаванням глюкози, тоді як додавання в лактозне
середовище глюкози при заморожуванні сперми знижує її якість.
Слід наголосити, що ефективність розріджувачів залежить не лише від їх складу,
але і від якості вихідних компонентів. Нетоксичні для сперміїв лише препарати, що
випускаються спеціально для штучного осіменіння тварин (спермосан–3, лактоза в
порошку, глюкозоцитрат у порошку, 2,9 %-й нейтралізований розчин цитрату натрію
у ампулах), оскільки заводи, що їх випускають, перевіряють їх на нешкідливість для
сперміїв. Якщо ж для штучного осіменіння використовуються не перевірені заводом
препарати, то спершу слід провести таку перевірку.
Приступаючи до виготовлення середовищ для розрідження сперми, слід пам’ята-
ти, що для цього можна використовувати лише хімічно чисті матеріали, які мають за-
водську етикетку з обов’язковим зазначенням ступеня чистоти (ЧДА, ХЧ). Не можна
використовувати відсирілі реактиви, оскільки в них неможливо враховувати кількість
ввібраної води. У відсирілих цукрах, як правило, розвивається мікрофлора і накопи-
чуються токсичні речовини. Медичні препарати повинні відповідати вимогам фар-
макопеї і не бути шкідливими для сперміїв. Нова серія кожного препарату, особливо
антибіотиків, піддається біологічному контролю, оскільки окремі з них можуть ви-
явитися токсичними для сперміїв. Жовток курячого яйця має бути яскраво-оранже-
вого кольору. Його отримують із свіжих курячих яєць (3–5 денного зберігання) від
здорових курей. Бажано, щоб кури, від яких отримують яйця, були вигульного утри-
мання і у їх раціоні містилося багато зелених кормів і вітамінів. Яйця з забрудненою
шкаралупою непридатні для використання.