ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 22.02.2019
Просмотров: 14926
Скачиваний: 16
220
Розділ 7
Вище наводились основні риси ембріона на ранніх стадіях його розвитку. Ці риси
слід чітко пам’ятати і по них оцінювати “вік” ембріона, його повноцінність. При ви-
миванні ембріонів з яйцепроводів практично всі вони бувають на стадії ранньої мору-
ли, тоді як при вимиванні ембріонів з рога матки більшість з них буває на стадії ран-
ньої бластоцисти. Внаслідок деякої розтягнутості суперовуляції тут можуть зустріча-
тися і морули, і пізні бластоцисти, і незапліднені яйцеклітини в стані дегенерації (зі
зморщеною, нерівної форми цитоплазмою), і, нарешті, зародки неправильної форми,
з порушеннями цілості прозорої оболонки, її розривами, розшаруваннями, стисненою
порожниною, нерівномірним дробленням, порушеннями міжклітинних зв’язків, гра-
нуляцією протоплазми. Відправною рискою при оцінюванні ембріонів є день циклу,
на який проводиться вимивання, і типічні для даного “віку” риси ембріона.
Ембріони, що різко відстали у своєму розвитку, з вираженими ознаками асинхрон-
ності дроблення бластомерів, їх дегенерації непридатні для трансплантації, тоді як
ембріони з незначними морфологічними змінами вважаються умовно придатними.
Значно більші зміни спостерігаються у збережених у замороженому стані ембріо-
нів, тому оцінка їх буває важчою.
Існує декілька підходів до оцінки ембріонів. Греве пропонує оцінювати їх за таки-
ми показниками: життєздатні – ембріони, стадія розвитку яких співпадає з їх віком,
що відраховується, починаючи з дня осіменіння; сповільнені (ретардовані) – ембріо-
ни, які виявляються на дещо ранніх стадіях розвитку, ніж очікувалося в зв’язку з їх
віком; вироджені (дегенеровані) – ембріони з різними ознаками дегенерації.
Райт класифікує ембріони за морфологічними ознаками на: нормальні; ембріони з
незначними відхиленнями; ембріони із збільшеною кількістю дегенерованих клітин.
М. І. Сергєєв та Ф. І. Осташко запропонували 5-бальну систему оцінки ембріонів
за морфологічними ознаками.
Проте на підставі морфологічної оцінки ембріонів важко зробити висновок про
їх життєздатність. Все залежить від їх розвитку в процесі культивування і від при-
живлення їх в розі матки. На жаль, точніших, а головне – доступних для виробництва
методів поки що немає.
В сумнівних випадках можна залишити вимиті ембріони в невеликій кількості по-
живного середовища на 30–40 хв. в термостаті для діагностичного культивування.
Короткотермінове збереження та культивування ембріонів. Від видобування
ембріонів у донорів до пересаджування їх реципієнту проходить звичайно не менше
3 годин. Протягом цього часу потрібно зберегти життєздатність ембріонів.
Для цього ембріон можна помістити в 0,5 мл середовища на годинниковому скель-
ці, поставити його в стерильну чашку Петрі, дно якої вистелене вологим фільтруваль-
ним папером, накрити і поставити в термостат з температурою 37 °С.
Для більш тривалого зберігання ембріона (у відповідному середовищі в ампулах,
поліхлорвінілових пайетах для осіменіння) засмоктують ембріон в пайету таким чи-
ном, щоб з обох боків його утворилися повітряні пухирці довжиною 1–1,5 см. Закри-
вають кінці пайети стальними кульками чи поліетиленовими корками і поміщають в
Трансплантація ембріонів
221
термостат при 37 ºС чи під шаром стерильного вазелінового масла на годинниковому
склі чи у пробірці.
В таких умовах біологічно повноцінні ембріони можуть зберігатися до 24–48 го-
дин, але в практичних умовах культивування при 37 °С застосовують лише як виму-
шений короткочасний захід.
В кінці культивування обов’язково перевіряють під мікроскопом життєздатність
ембріонів.
Одним з прикладів успішного зберігання ембріонів при температурі тіла є досліди
кембріджських вчених по пересаджуванню ембріонів овець у яйцепроводи кролиці,
які дозволили здійснити ряд міжконтинентальних перевезень ембріонів з послідую-
чою їх ретрансплантацією. Після хірургічного пересаджування таких ембріонів отри-
мано нормальних нащадків.
Можна також зберігати ембріони при знижених плюсових температурах, що ви-
кликають зворотне гальмування метаболічних процесів.
Кріоконсервування ембріонів. Ще в 1953 р. О. Сміт вперше вдалося заморозити
ембріони кролика, проте для перенесення цих дослідів на сільськогосподарські тва-
рини потрібно було біля 20 років.
Оптимальною стадією для заморожування ембріонів великої рогатої худоби є ран-
ня бластоциста, овець і кіз – пізня морула чи рання бластоциста, свиней – бластоцис-
та; краще переносять заморожування свіжі ембріони.
Заморожування та розморожування ембріонів може супроводжуватися кристалі-
зацією води в бластомерах та концентрацією розчинених речовин у рідкій фазі. Ці
два процеси можуть проявлятися одночасно, хоча кристалізація більш виражена при
відносно швидкому, а осмотичні зміни – при повільному заморожуванні.
Слід підкреслити, що процес заморожування ембріонів є набагато складнішим від
заморожування сперми, оскільки ембріони є багатоклітинними утвореннями. Тому
дуже важлива роль відводиться підготовці ембріонів до заморожування, їх захисту від
температурних та осмотичних пошкоджень.
В процесі заморожування ембріонів спочатку знижується температура в навколо-
клітинному середовищі, тут поступово збільшується кількість льоду, тоді як в решті
розчину зростає концентрація солей.
Виникає таким чином різниця осмотичного тиску між позаклітинною та внутріш-
ньо-клітинною фазами, яка може бути зрівноважена шляхом віддачі клітинами води в
позаклітинне середовище.
Для уникнення кристалізації внутрішньоклітинної води до складу середовища до-
дають кріопротектори диметилсульфоксид (ДМСО) чи гліцерин, а щоб не допустити
осмотичних зрушень – штучно стимулюють кристалізацію на певній стадії. Проте
саме введення до складу середовища з ембріонами кріопротектора, як і його видален-
ня, може викликати осмотичні зрушення. Тому, це насичення (еквілібрацію) роблять
поступово,
поміщаючи ембріони на годинникових стеклах в чашках Петрі спочатку
на 5–10-хв. у 0,25 М розчин ДМСО, тоді – в 0,5 М, 1,0 М і нарешті – 1,5 М розчин.
222
Розділ 7
В останньому розчині ембріони витримують 15–20 хвилин. Якщо кріопротектором
служить гліцерин, то спочатку ембріони поміщають на 10 хв. у 3,3 %-ий його розчин,
тоді на 14 хв. у 6,6 %-ий і в кінці на 30 хв. у 10 %-ий розчин. Після розморожування
ембріонів їх також відмивають від кріопротектора, переносячи поступово з розчинів
з більшою концентрацією кріопротектора в менш концентровані розчини.
Закінчивши насичення ембріонів кріопротектором їх розфасовують по пробірках,
ампулах чи пайетах для заморожування, яке проводять одно- чи двоетапним методом,
повільно чи швидко. В пайети ембріони поміщають в такій послідовності: середови-
ще – повітря – середовище з ембріоном – повітря – середовище. Кожен стовпчик по-
винен займати в пайеті біля 1–2 см довжини. Один край пайети закривають зволоже-
ним корком.
Для зниження перепаду температур і уникнення осмотичних змін, за 4–5 ºС до
початку льодоутворення стимулюють кристалізацію, додаючи до розчину зернину
льоду, кристалик йодистого срібла чи просто переохолоджений предмет (проколюють
фольгу пінцетом з намерзлою на кінці краплею середовища і швидко торкаються ним
поверхні рідини).
Повільне заморожування і повільне розморожування ембріонів. Охолоджу-
ють ембріони від 20 ºС до –7 ºС зі швидкістю 1 ºС/хв., викликають кристалізацію і
тоді охолоджують зі швидкістю 0,3 ºС/хв. до –36 °С
,
далі – зі швидкістю 0,1 ºС/хв. до
–60 °С і переносять в рідкий азот.
Розморожують ембріони в спиртовій бані – скляній циліндричній колбі з температу-
рою –50 °С, куди поміщають пробірки чи ампули з ембріонами і розморожують зі швид-
кістю 4 °С/хв. до 10 °С, після чого переносять на 5 хв. у водяну баню з температурою
20 °С. Нарешті, переносять ембріони в середовище для видалення кріопротектора.
Швидке заморожування та розморожування ембріонів. Охолоджують ембрі-
они у міні-пайетах – від 20 ºС до 7 ºС зі швидкістю 1 ºС/хв., викликають кристаліза-
цію і тоді охолоджують зі швидкістю 0,3 ºС/хв. лише до –30 ºС і переносять в рідкий
азот. Розморожують ембріони у водяній бані з температурою 37 °С протягом 30 сек.
зі швидкістю 3,0 °С/хв.
НДІ тваринництва Лісостепу і Полісся УРСР запропонував свою технологію за-
морожування ембріонів: свіжовимиті ембріони переносять на 10 хв. в 0,5 М розчин
ДМСО на середовищі ФБС, тоді на 20 хв. в таке ж середовище з 1,3 М ДМСО, після
чого, по 3–4 зародки переносять в уленгутівську пробірку з 0,5 мл 1,0 М ДМСО на
ФБС, герметизують пробірку і поміщають у програмний апарат для охолодження і
заморожування.
Заморожування ведуть за такою програмою: від 22–25 °С до 6 °С зі швидкістю
1 °С/хв., штучно збуджують кристалізацію середовища і заморожують від –7 °С до
–40 °С зі швидкістю 0,3 °С/хв., від –40 °С до –60 º С – зі швидкістю 0,1 ºС/хв., після
чого переносять пробірки з охолодженими до –60 °С ембріонами в рідкий азот.
Останнім часом запропоновані технології заморожування ембріонів у соломин-
ках, які містять одночасно два середовища – для заморожування (рідина Дюльбекко з
Трансплантація ембріонів
223
10 %-им гліцерином і поміщеним в ній ембріоном) і середовище для розморожування
(рідина Дюльбекко з 20 % фетальної сироватки і 0,5 М розчином сахарози). Після
розморожування соломинку струшують (для змішування середовищ), витримають на
10–20 хв. при кімнатній температурі і пересаджують ембріон реципієнту.
При заморожуванні ембріонів необхідно суворо дотримуватися технології. За-
морожування ембріонів дозволяє значно вдосконалити організацію трансплантації і
відпадає потреба утримання великої кількості реципієнтів і термінового пересаджу-
вання вимитих ембріонів. Замість цього можна створювати банки ембріонів, прово-
дити трансплантацію розморожених ембріонів реципієнтам після спонтанної охоти,
проводити їх експорт та імпорт.
7.8. Пересаджування ембріонів
До середини 70-х років пересаджування ембріонів робили в основному хірургіч-
ними методами, тоді поступово стали запроваджувати нехірургічні методи. Як перші,
так і другі мають свої позитивні та негативні властивості.
Хірургічний метод вимагає хірургічних навичок, спеціального приміщення, від-
повідного обладнання та інструментів; він дозволяє вводити ембріони глибоко в ріг
матки, що не вдається при нехірургічному пересаджуванні. До того ж в останньому
випадку необхідно пройти спеціальним інструментом крізь родові шляхи геть аж до
середини рога матки. Шийка матки в цей період буває закритою, а її слизова оболонка
легко травмується; в геніталії може заноситися мікрофлора.
Для полегшення введення інструментів іноді застосовують препарати, що заспо-
коюють тварин та розслабляють шийку матки.
Ефективність пересаджування ембріонів залежить перш за все від синхронності
охоти у донорів і реципієнтів, оскільки стан ендометрію повинен відповідати “віко-
вим” змінам ембріона.
Хірургічне пересаджування ембріонів. Хірургічний метод пересаджування
ембріонів належить до порожнинних операцій, тому проводити його необхідно в
операційній, обладнаній універсальним фіксаційним станком чи операційним сто-
лом. Лапаротомію проводять по білій лінії черева під загальним наркозом при спин-
ному положенні тварини або в області голодної ямки під місцевою анестезією на
стоячій тварині.
Для пересаджування ембріонів можна користуватися модифікованою пастерів-
ською піпеткою з лійкоподібним розширенням на кінці капіляру та герметичною
гумовою насадкою на протилежному кінці, приладом Кассу для штучного осіме-
ніння, за допомогою пайет, російських або французьких звичайних чи телескопіч-
них катетерів.
Застосовувані інструменти повинні бути чистими і стерильними.
Заправляють пайети ембріонами так же, як для заморожування, тобто спочатку
набирають стовпчик середовища Дюльбекко довжиною 1,5–2 см, тоді такий же стовп-
224
Розділ 7
чик повітря, далі засмоктують ембріон разом з середовищем, знову стовпчик повітря
і нарешті стовпчик середовища.
Одягають на піпетку стерильний поліетиленовий чохол чи накривають її стериль-
ною серветкою і зберігають в боксі
В
горизонтальному положенні до пересаджування.
Підготовка тварини до операції і оперативні доступи до матки такі ж, як при ви-
миванні ембріонів. При лапаротомії по білій лінії живота знаходять в черевній порож-
нині яєчник з активним жовтим тілом; виводять за маткову зв’язку іпсілатеральний ріг
матки назовні (в момент розслаблення) і тупою голкою (діаметром 1–1,5 мм) чи мо-
лочним катетером проколюють ріг матки приблизно в 5 см від матково-трубного з’єд-
нання. Вводять в утворений отвір капіляр-піпетки з ембріоном в напрямку верхівки
рога матки ближче до його матково-трубного з’єднання і зіштовхують вміст піпетки
у просвіт рога матки, на його слизову оболонку. Таким же чином переносять другий
ембріон в другий ріг матки. При цьому не можна торкатися стінок рога матки.
Щоб переконатися, що ембріони пересаджено в матку, перевіряють використані
піпетки під мікроскопом.
Закінчивши пересаджування, перевіряють, чи зайняла матка вихідне положення
і вводять у черевну порожнину 250 мл фізрозчину з антибіотиками (по 500 тис. ОД
пеніциліну та стрептоміцину в 50 мл новокаїну). Накладають триповерховий шов і
залишають реципієнта під наглядом протягом двох тижнів.
Пересаджування ембріонів через розріз черевної стінки в області правої чи лівої
голодної ямки значно простіше і менш трудомістке. Готують реципієнта до операції і
здійснюють операційний доступ так же, як при вимиванні ембріонів цим методом.
Відкривши доступ до внутрішніх органів, вводять через розріз руку в черевну
порожнину, захоплюють великим та вказівним пальцями маткову зв’язку протилеж-
ного рога матки, виводять його назовні, пересаджують в його просвіт ембріон (як в
попередньому випадку), тоді аплікують ембріон в другий ріг матки. Опускають матку
на місце, вводять в черевну порожнину антибіотики, накладають тришаровий шов
та клейову пов’язку. Тварина залишається під наглядом протягом двох тижнів, після
чого знімають шви.
Ефективність хірургічного пересаджування ембріонів висока, біля 60 %, тому не
випадково в багатьох зарубіжних центрах користуються переважно цим методом з
лапаротомією в області голодної ямки.
Правда нанесення тварині травми внаслідок резекції м’язів, неможливість багато-
разового використання тварини, складності самої операції стримують широке засто-
сування цього методу.
Нехірургічне пересаджування ембріонів. Перші досліди по нехірургічному пере-
саджуванню ембріонів проведено на початку 60-х років. Застосовувані сьогодні ін-
струменти складаються в основному з металевого катетера та довгої капілярної труб-
ки, в передній частині якої є приставка для поміщення ембріона в невеликій кількості
середовища.