ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 22.02.2019
Просмотров: 14930
Скачиваний: 16
Трансплантація ембріонів
225
Якщо пересаджування здійсню-
ють за допомогою гнучкого приладу
Касу, то ембріон необхідно помістити
в пайету (як вказано вище), вставити
пайету в наконечник приладу, з’єд-
нати його з основною трубкою. При
використанні приладу ВІТ ембріон в
такій же послідовності поміщають в
кінцеву пластикову частину катетера.
Підготовку тварини до нехірургічного пересаджування ембріонів проводять так
же, як до нехірургічного вимивання ембріонів – фіксують у станку, наводять туа-
лет перинеальної області, роблять сакральну анестезію 2 %-им розчином новокаїну,
(5 мл), сильнозбудливим тваринам вводять також міорелаксант комбелен (0,5 мл).
Беруть у праву руку відповідним чином підготований і заправлений ембріоном
катетер і вводять його по верхньому склепінню піхви до шийки матки. Накривають
зовнішню частину приладу серветкою (або ж одягають на інструмент гінекологіч-
ну рукавицю) і вводять ліву руку в пряму кишку. Промацують матку, визначають в
якому яєчнику є жовте тіло і скеровують наконечник катетера в цервікальний канал.
Переконавшись, що катетер введено в шийку матки, обережно натягують її на катетер
і проштовхують його в іпсілатеральний ріг матки. Обережними рухами просувають
катетер як можна ближче до верхівки рога матки, постійно контролюючи ректально
місце знаходження голівки катетера.
Пересвідчившись у вірності введення інструмента, подають команду помічнику
ввести вмістиме катетера в матку. Після цього обережними рухами виймають катетер
і передають його на обробку.
Аналогічним чином можна ввести інший катетер в другий ріг матки і зробити так
зване білатеральне (двостороннє) пересаджування ембріонів, хоча приживлення їх в
контрлатеральному розі буває дещо нижчим. М. І. Сергєєв отримував при таких пере-
саджуваннях 55–60 % народжень двійнятами.
На перший погляд пересаджування ембріонів дещо нагадує цервікальне осіменін-
ня корів з ректальною фіксацією шийки матки. Фактично ж вона значно складніша.
Якщо під час осіменіння шийка матки буває відкритою, а цервікальний слиз воло-
діє високими бактерицидними властивостями, то під час пересаджування ембріонів
шийка матки буває закритою, порожнина матки – стерильна, слизові оболонки гені-
талій легко травмуються, бактерицидні властивості маткового секрету знижені. Все
це необхідно враховувати при роботі, звертаючи особливу увагу на асептику та анти-
септику і, безумовно, на майстерність роботи.
Слід також пам’ятати, що резистентність геніталій в лютеїнову фазу буває зниже-
ною, а чутливість ендометрію до інфекції – підвищеною, тому бактеріальна інфекція,
яка може проникнути в матку при пересаджуванні зародків, є другою за своєю важли-
вістю причиною низької результативності трансплантації ембріонів.
Рис. 47. Пересаджування ембріонів.
226
Розділ 7
Третім моментом частих невдач є травмування ендометрію інструментами. Кро-
вовиливи, що при цьому виникають, негативно впливають на виживання ембріонів,
оскільки непрогріта кров є ембріонотоксичною.
Не рекомендується протягом двох місяців після пересаджування вакцинувати, пе-
регруповувати чи піддавати іншим стресовим впливам реципієнтів. Через 60–73 днів
після пересаджування ембріонів реципієнтів досліджують на вагітність.
Трансплантація ембріонів у інших видів тварин.
Розроблені методи трансплантації ембріонів і для інших видів тварин, правда
поки що вони мають більш наукове, ніж прикладне значення.
У овець добування та пересаджування ембріонів проводять лише хірургічним ме-
тодом, під загальним чи місцевим наркозом. Р. Аверіл з співробітниками в 1957 р.
вперше застосували метод інкубації зигот вівці в організмі кролиці. Вони пересадили
семи кролицям 18 овечих ембріонів на стадії 2-х–12-ти бластомерів. Через 4–5 днів
кролиць забили і з порожнини матки вимили 9 морул та бластоцист. Дві бластоцисти
пересадили вівцематці, у якої овуляція мала місце 6 днів раніше. Через 16 днів її за-
били і виявили в рогах матки два нормально розвинені ембріони.
6 квітня 1961 року в англійській газеті “Дейлі експрес” повідомлялося про ори-
гінальний дослід, проведений С. Адамсом та Л. Роусоном. Автори пересадили овечі
ембріони в яйцепроводи кролиці, яку опісля перевезли в Наталь на віддаль 6 000 миль
і отримали після пересаджування приплід (до цього, в 1954 р. М. Ченг та В. Мар-
ден перевозили авіапоштою в посудині Дьюара в сироватці крові ембріони кролика
із США в Кембрідж і отримали після трансплантації двох кроленят). В 1965 р. в АН
Казахстану під керівництвом академіка Ф. М. Мухамедгалієва проведено широкопла-
нові дослідження по трансплантації ембріонів овець.
В досліді по трансплантації ембріонів, отриманих внаслідок суперовуляції, із яй-
цепроводів однієї вівцематки вдалося видобути до 14-ти ембріонів на стадії 2-х–8-ми
бластомерів. Восени 1975 р. внаслідок трансплантації таких ембріонів від вівцематки
№ 1757/9891 породи Лінкольн отримано 9 ягнят – в т. ч. 5 баранчиків. Вирощені ба-
рани-трансплантанти в 1976–1979 рр. були використані для осіменіння овець. В ре-
зультаті отримано 6 850 ягнят, в тому числі отара ярок (3 000). Таким чином, від овець
породи Лінкольн, які важко акліматизувалися в умовах Казахстану, отримало велику
кількість баранів-плідників і створено стадо кросбредних овець.
Що ж стосується гормонального викликання багатоплідної вагітності у овець, то
воно не доцільне, оскільки при цьому зростає смертність приплоду.
Першу трансплантацію ембріонів у свиней здійсняв О. В. Квасницький, переса-
дивши 9 ембріонів, добутих з яйцепроводів миргородської свині, свиноматці великої
білої породи і отримав 4-х поросят-трансплантатів. В 60–70-х роках вдосконалено
методику ембріопересаджувань, проведено досліди по міжконтинентальному пере-
везенню ембріонів свиней з Канади у Великобританію (Вратали та ін.) та із США в
Іспанію (Джеймс і Рісер) і Великобританію (Джеймс з співробітниками).
Трансплантація ембріонів
227
Вимивання та пересаджування ембріонів проводять хірургічним методом через
1–3 дня після осіменіння, головним чином з метою підвищення ефективності вико-
ристання генетичного потенціалу елітних свиней, інтродукції нових тварин в замкну-
тих стадах, отримання нащадків від неплідних елітних свиноматок та в карантинних
стадах. Оптимальним вважається перенесення 12–18-ти ембріонів одному реципієн-
ту. Свиноматки не здатні виношувати більше плодів, ніж відбулося овуляцій. При пе-
ресаджуванні менше 4-х ембріонів вагітність не зберігається.
Складність трансплантації ембріонів у кобил полягає в тому, що у них важко ви-
кликати суперовуляцію за допомогою екзогенних гонадотропінів. Тому збільшення
кількості приплоду від цінних кобил за допомогою трансплантації можна досягну-
ти шляхом багаторазового отримання поодиноких ембріонів нехірургічним методом.
Розповсюдження методу в конярстві обмежується також асоціацією з реєстрації по-
родних коней, яка довший час не визнавала нащадків, отриманих шляхом штучного
осіменіння чи трансплантації ембріонів.
7.9. Нові напрямки біотехнології відтворення
Великим резервом підвищення ефективності відтворення тварин є більш повне
використання наявних у яєчниках овоцитів через запліднення їх поза організмом. В
1981 р. у США та в Радянському Союзі (Л. К. Ернст зі співробітниками) вдалося успіш-
но запліднити недозрілі овоцити великої рогатої худоби і отримати перших телят.
Метод багатообіцяючий і якщо в медицині його використовують сьогодні резуль-
тативно, то цього не можна сказати про тваринництво.
Ооцити для запліднення поза організмом можна брати від телиць, корів, та навіть
телят. Miyamura з співр. (1996), досліджуючи яєчники двох корів чорної японської
породи виявили у першої корови 86 182 фолікули, з них 82 572 (95,8 %) були первин-
ними, 2 530 (2,9 %) – примордіальними, 837 (1,0 %) – вторинними і 243 (0,3 %) – по-
рожнинними. У другої корови виявлено 68 156 фолікулів, співвідношення яких було,
відповідно, 62 990 (92,4 %), 4 058 (6,0 %), 833 (1,2 %) і 275 (0,4 %).
У яєчниках пренатальних плодів виявляли від 75 000 до 300 000 ооцитів, кількість
яких з віком зменшується.
В яєчниках 5-денних телят уже виявляли фолікули діаметром 5 мм. У 7-місячних
телят виявляли біля 50 фолікулів (Evans з співр., 1994). Автори вважають, що вико-
ристання ооцитів плодів та статево недозрілих телят для запліднення in vitro є засо-
бом значного генетичного прискорення процесу відтворення.
Запропоновано методику ICI (intra cell insemination) – ін’єкцію одного відібраного
спермія в цитоплазму яйцеклітини або під прозору оболонку, що полегшує процес
“злиття” гамет. Ця методика знайшла практичне застосування у гуманній медицині у
випадку низької концентрації сперміїв у донора чи з розладами їх рухливості (Iritani
з співр., 1995).
228
Розділ 7
До методик полегшення контакту спермія з яйцеклітиною належать:
1. Часткове розрихлення прозорої оболонки за допомогою ензимів трипсину чи
пронази, або ж видалення оболонки.
2. Порушення цілості прозорої оболонки за допомогою мікроголки чи лазера, або ж
розрихлення її цівкою розчину низької кислотності (ФБС чи розчин Тіроде з рH 2,5).
3. Ін’єкції капацитованого спермія чи декількох сперміїв під прозору оболонку.
4. Ін’єкції спермія до цитоплазми ооциту (intracytoplasmic sperm injection, ICSI).
Для цього можуть бути використані будь-які спермії, в тому числі нерухомі, мертві,
морфологічно змінені, окремі голівки сперміїв.
Заслуговує уваги ідея стимулювання дозрівання фолікулів у статевонедозрілих
тварин, що дозволить скоротити інтервал між поколіннями і прискорити ранню оцін-
ку тварин за нащадками.
Успіх запліднення залежить від ступеня зрілості як овоцитів, так і сперміїв. Тому
цілком природними є пошуки середовищ для культивування та капацитацїї сперміїв.
Проводяться досліди по заплідненню овоцитів великої рогатої худоби спермія-
ми бугая в яйцепроводах інших видів тварин. Науково-технічний прогрес в області
трансплантації ембріонів дозволяє в недалекому майбутньому перейти на визначення
статі у пересаджуваних ембріонів. Запропоновано це робити за допомогою хромо-
сомного аналізу вирізаного кусочка трофобласта, імунологічної ідентифікації на по-
верхні ранніх ембріонів специфічних антигенів, визначення статевого хроматину у
інтермітотичних ядрах клітин та ін., на жаль ці методики ще не доведені до практич-
ного застосування у виробничих умовах.
Великі перспективи обіцяє розділення ембріонів на бластомери, які на початкових
стадіях дроблення є тотипотентними, тобто кожен з них може розвинутися в окремий
зародок.
Таким чином, з одного ембріона можна копіювати (клонувати) ідентичних (моно-
зиготних) близнят і значно підвищити ефективність використання донорів. З цією ме-
тою користуються методами мікрохірургічного, ферментативного чи хімічного розді-
лення ембріонів на половинки, четвертинки і т. д.
Практиків тваринництва давно цікавить можливість раннього визначення статі за-
родків та її регуляції.
Серед наявної інформації найбільше уваги приділяли саме таким напрямкам до-
сліджень.
Найперспективнішим є метод розділення сперміїв на носіїв хромосоми Y та X,
яке дозволяє визначати стать вже під час запліднення. Проте чисельні дослідження не
дали бажаних наслідків. Окремі методики з цієї серії робіт базувалися на визначенні
вмісту ДНК, вміст якої в одному спермії бугая, барана та кнура становить 3,36; 2,93
та 2,60 пг. Хромосома Х є більшою і отже містить більше ДНК, ніж хромосома Y, але
різниця вмісту ДНК у сперміях Х і Y у бугая становить 3,9 %, кнура – 3,7 % і бара-
на – 4,2 % (Johnson і Clarke,1988), тобто, надто малі для визначення статі.
Трансплантація ембріонів
229
Дещо ефективнішою виявилася методика розділення Х та Y-сперміїв шляхом цен-
трифугування чи вільно-проточного електрофорезу, використання антитіл проти від-
повідного типу сперміїв, цитогенетичного аналізу плодових вод, але і вони не готові
до практичного використання.
Найперспективнішими на даний час є гормональні дослідження плодових вод,
крові плода, а то і крові матері після імплантації зародка. Найкращі результати дає
визначення тестостерону, вміст якого в алантоїсній рідині на 100-й день вагітності
вище 320 пг/мл є показником чоловічої статі плода, а нижче 240 пг/мл – жіночої статі
(Basrur і Bongso,1980).
Перспективним є застосування полімеразно-ланцюгової реакції, що передбачає
біопсію 5–10 бластомерів 6,5–7-денного зародка і екстрагування з них ДНК. Прижив-
лення таких зародків у дослідах Ellis з співр. (1988) становило 44 %.
Заслуговує на увагу ультрасонографічний метод, який базується на виявленні ста-
тевого виростка у плода, що є зачатком прутня у самців чи клітора у самиць, і може
бути виявленим на 55-й день вагітності (Curran з співр.,1992).
В Австралії опрацьована комплексна технологія трансплантації ембріонів, що
включає швидке (менш, ніж за три години) визначення статі ембріона за допомогою
полімеразної ланцюгової реакції-виявлення Y-хромосоми ДНК, характерної лише для
чоловічої статі. Запропоновано портативну тест-систему для визначення статі ембрі-
она безпосередньо на фермі.
Важливими слід визнати також дослідження з отримання химерних тварин – орга-
нізмів, що складаються з генетично різнорідних тварин чи клітин. Практично химери
можна отримувати шляхом з’єднання двох ембріонів чи двох половинок ембріонів від
різних (зразу чотирьох) батьків.
Проте методика отримання химер дуже складна. Наприклад, при мікрохірургіч-
ному отриманні химер розтинають спеціальним мікроножем прозору оболонку, видо-
бувають тонким гачком ембріон, розрізають його на половинки і кожен такий новий
“половинчастий” зародок пересаджують у порожні прозорі оболонки незапліднених
яйцеклітин, дегенерованих зародків чи ооцитів і з них формуються бластоцисти в
такому ж темпі, як і з неоперованих зародків. Нормальний розвиток зародків порушу-
ється лише після поділу їх на 4 і більше частин.
Застосовують також ін’єкції окремих бластомерів у внутрішньоклітинну масу ін-
шого ембріона. Широко застосовуються також хімічні, фізичні, імунобіологічні мето-
ди (для розчинення прозорої оболонки роз’єднання бластомерів, їх злиття і т. п.).
Розділені навпіл ембріони впродовж 30-хвилинної інкубації відновлюють свої
морфологічні особливості (Albihn з співр. 1990).
Химеричні зародки можуть знайти застосування при отриманні міжвидових ва-
гітностей або при ін’єкуванні у бластоцисту відповідних генів із стовбурових клітин.
Такі химеричні зародки лабораторних тварин інкубують певний час у відповід-
ному середовищі, а зародки домашніх тварин – у перев’язаному яйцепроводі вівці.
Характерною рисою химер є унікальність кожної з них.