Файл: Особенности приготовления.docx

Министерство здравоохранения Хабаровского края

Краевое государственное бюджетное

профессионально образовательное учреждение

«Хабаровскии государственныи медицинскии колледж»

имени Г.С. Макарова

(КГБПОУ ХГМК)

ДОПУСТИТЬ К ЗАЩИТЕ

Зам. директора по УМР

_____________ Новик Е.С.

«____» ___________202____г.

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА

по теме:

ОСОБЕННОСТИ ПРИГОТОВЛЕНИЯ

ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

ИЗ ХРЯЩЕВОИ И КОСТНОЙ

ТКАНЕЙ
Студент 4 курса

Специальности 31.02.01 ________________ Перевезник К. А.

Лабораторная диагностика (подпись, дата)

очной формы обучения

Научныи руководитель:

Преподаватель ________________ Царскии И. Ф.

КГБПОУ ХГМК (подпись, дата)
Рецензент:


г. Хабаровск 2023

Оглавление

Введение

Гистология – немаловажная наука в современном мире. Она дает ответы на многие вопросы, касающиеся заболеваний или изменений в организме, которые незаметны невооруженным глазом. Наиболее часто встречаемые на протяжении всей истории проблемы были связанны с костями и суставами, какой бы временной промежуток не был взят. И даже в современном мире, несмотря на уровень развития медицины, все еще актуально изучение и разработка на основе полученных данных новых путей решения тех или иных задач, связанных с костными и хрящевыми структурами в организме.

---

Наиболее наглядную и развернутую информацию можно получить благодаря гистологическим срезам. В своей дипломной работе я хочу более подробно описать способы и методы, а так же особенности создания гистологических препаратов костной и хрящевой ткани.

Актуальность дипломной работы обусловлена тем, что многие современные разработки в плане лечения болезней, связанных с проблемами с суставами и костями, не могут обойтись без создания качественных гистологических препаратов для наглядного сравнения результатов проведенных исследований.

Цель дипломной работы: описать этапы создания, а также различные методы и способы создания гистологических препаратов костной и хрящевой ткани.

Задачи дипломной работы: описать процесс фиксации, способы обезвоживания материала, разъяснить роль уплотнения, заключения срезов, окрашивания, а также контроля качества. Помимо прочего ознакомить с возможными погрешностями, особенностями приготовления серии парафиновых срезов, депарафинирования. Также следует перечислить материалы и их особенности для фиксации, описать процесс декальцинации, дальнейшей обработки и последующей заливки декальценированного материала, а еще объяснить смысл приготовления гистотопографических препаратов. И напоследок описать процесс окрашивания срезов декальценированной кости.

1. Объекты и методы изучения в гистологии

Гистология, как любая наука, имеет свои объекты и методы их изучения. Непосредственными объектами изучения являются клетки, фрагменты тканей и органов, особым способом приготовленные для изучения их под микроскопом.

1. Фиксация материала

Это первый и очень ответственный этап в гистологической технике, призванный сохранить ткани и органы в состоянии, близком к тому, в котором они находились до момента смерти. В тканях при фиксации происходят сложные физико-химические изменения, в частности коагуляция (осаждение) белков. Фиксаторов, которые бы полностью сохраняли структуру, нет. Они существенно уплотняют ткани, уменьшают их объём, приводят к необратимым изменениям. Фиксатор в разной степени сохраняет разные структуры. Если при фиксации вещество разрушается, то нефиксированный материал замораживают и высушивают на холоде (лиофилизация). При этом не происходит денатурации белков, снижение активности ферментов, но изменяется форма клеток.

---

Чтобы не произошло образования кристаллов, производят быструю заморозку при температуре от 30 до 60° С. Высушивание ускоряется в условиях вакуума (в специальных аппаратах). Заливку материала в среды проводят быстро, во избежание увлажнения

Цель фиксации - убить клетку, прекратить происходящие в ней процессы (прежде всего ферментативные) и, по возможности, сохранить ее прижизненное строение.

Существует ряд общих правил фиксации: 1) объем фиксирующей жидкости должен не менее чем в 20 раз превышать объем фиксируемого кусочка ткани; 2) фиксатор должен иметь доступ к фиксируемому материалу со всех сторон, по этому на дно сосуда кладут вату или кусочек фильтровальной бумаги или подвешивают кусочек на нитке; 3) продолжительность фиксации зависит от свойств фиксатора, прежде всего от скорости проникновения фиксатора в ткань; 4) различные фиксаторы сохраняют различные структурные и химические компоненты клетки.

Большинство фиксаторов оказывает уплотняющее действие на обрабатываемый материал. Размер исследуемых кусочков должен быть таким, чтобы произошло полное его пропитывание в оптимальные для данного фиксатора сроки. В среднем для большинства фиксаторов берут кусочки толщиной 5-10 мм.

---

1.2 Обезвоживание материала

После фиксации, для которой применялся формалин, кусочки промывают в течение 6,12 или 24 ч в проточной воде: на водопроводный кран надевают резиновую трубку, конец которой опускают в широкогорлую банку, закрытую марлей. Для промывки удобно использовать эксикаторы разных размеров, снабженные краном: в отверстие крышки эксикатора опускают шланг, по которому подают воду, а через кран эксикатора ее сливают.

В том случае, если в состав фиксатора входила пикриновая кислота, материал следует промыть в нескольких сменах 70% спирта, после фиксации с использованием сулемы в йодированном 70% спирте. Материал, фиксированный для некоторых гистохимических реакции, электронномикроскопического и иммуноцитохимического исследовании, отмывают от фиксаторов в различных буферных смесях.

В случае необходимости кусочки тканей перед обезвоживанием можно уменьшить, подровнять. Если материал после фиксации не сразу подлежит проводке, то его можно оставить в 70-80% спирте.

Способы обезвоживания тканей

Перед заливкой материала в парафин пли целлоидин его необходимо обезводить. Существует несколько традиционных способов обезвоживания. Самым распространенным является обезвоживание в спиртах восходящей концентрации, начиная с 70%. Обычно применяют батарею спиртов, состоящую из двух порции 96% и двух - 100% спирта. Продолжительность процесса обезвоживания в спиртах в среднем 48 ч в зависимости от качества материала (содержания жира в ткани) и размера кусочков, а также от их количества. При использовании автомата для заливки количество спиртов увеличивают, а при проведении кусочков по спиртовой батарее вручную их осторожно промокают фильтровальной бумагой или салфеткой из марли, что позволяет реже менять спирты в батарее.

Процесс обезвоживания можно ускорить, перйодически встряхивая кусочки в банках со спиртами или поместив их в термостат при 37°С. Спирты в батарее необходимо своевременно заменять. Контролировать пригодность спирта позволяет проба с водой. В отлитое из банки небольшое количество спирта добавляют 1 каплю воды. Помутнение раствора свидетельствует о необходимости замены спирта в батарее.

---

Абсолютный спирт можно приготовить из 96%. Для этого применяют сульфат меди, который помещают в ступку и прокаливают на спиртовке или в термостате, периодически растирая и размешивая до консистенции пыли и бледно-голубого цвета. Затем сульфат меди засыпают в банку с 96% спиртом (4 или 6 частей), плотно закрывают ее крышкой, взбалтывают и оставляют на несколько дней, периодически встряхивая. Сульфат меди адсорбирует воду из спирта и вновь приобретает синюю окраску. Перед использованием абсолютного спирта проводят его контроль спиртометром или в пробирку с небольшим количеством ксилола (4-5 мл) добавляют каплю приготовленного спирта (раствор мутнеет, если спирт недостаточно обезвожен). Хорошим адсорбентом воды из спирта является также силикагель после предварительного просушивания его в термостате.

При отсутствии 100% спирта в батарею включают еще одну порцию 96% спирта. Однако в этом случае всегда есть опасность недостаточного обезвоживания и возникновения трудностей при получении срезов.

С целью ускорения обезвоживания применяют ацетон без примесей (ЧДА), предварительно добавив в него силикагель для удаления остатков воды или дистиллированный ацетон. Обезвоживание проводят в 2-3 сменах ацетона от нескольких часов до 1 суток в зависимости от величины объектов. Обезвоживание тканей возможно с помощью 99% изопропилового спирта, который непосредственно смешивается с парафином без промежуточных растворителей (ксилол, хлороформ и др.). Таким же свойством обладает диоксан, однако в связи с высокой токсичностью он не нашел широкого применения в патогистологической технике

Для обезвоживания глицерином кусочки ткани последовательно помещают в 60%, 80% и 100% глицерин на 3-4 ч, а затем в смесь, состоящую из равных частей 100% глицерина и ксилола.

Выраженное влияние на скорость обезвоживания оказывает микроволновое излучение. Объекты в 70% спирте помещают на 20 с. в микроволновую печь (2,5 Гц/500 В), а затем дообезвоживают в абсолютном спирте в течение 30-60 мин.

Секционный и биопсионный материал часто обезвоживают в аппаратах типа АТ-5 и др. с последующим пропитыванием толуолом, хлороформом или их смесью с парафином. При этом применяют две порции 96% спирта и две - 100%. Общая продолжительность обезвоживания 48 ч. Преимущество использования аппаратов состоит в том, что в них материал постоянно перемешивается и находится во взвешенном состоянии. Однако аппарат не включается автоматически после внезапного перепада напряжения в электрической сети, что может привести к пересушиванию большого количества материала.

---