Файл: Особенности приготовления.docx

Для контроля за завершением декальцинации используют различные тесты. Наиболее простыми являются сгибание или сжимание кусочков пальцами, пробныи надрез, прокалывание кусочка препаровальной иглой. Для выполнения этих тестов требуется большой практический опыт, и ни один из них не может быть признан удовлетворительным, так как возможно повреждение материала, в частности при прокалывании кусочков иглой.

Химические тесты основаны на определении содержания кальция в декальцинирующей жидкости. Кальциноксалатный метод позволяет обнаруживать в ней кальции за счет преципитации нерастворимых гидроокиси и оксалата кальция. Для проведения этого теста берут приблизительно 3 мл использованной декальцинирующей жидкости, опускают в нее маленький кусочек лакмусовой бумаги и добавляют по каплям концентрированный аммонии до тех пор, пока раствор не станет нейтральным (взбалтывают после добавления каждой капли). Затем добавляют примерно 5 мл насыщенного раствора оксалата аммония, хорошо взбалтывают и оставляют на 30 мин.

Образование преципитата после добавления оксалата аммония свидетельствует о том, что в декальцинирующей жидкости имеется значительное количество кальция. Преципитация, поступающая после добавления оксалата аммония, также позволяет сделать вывод о наличии кальция в декальцинирующей жидкости, но в меньшем количестве. Если исследуемая жидкость остается прозрачной в течение ЗО мин, то ато означает, что декальцинация завершена.

Этот метод не применяют в тех случаях, когда декальцинирующая жидкость содержит свыше 10 % кислот. Однако такая жидкость может быть разведена или ее рН увеличен до 4,5 посредством добавления раствора гидроксида натрия непосредственно перед началом выполнения теста, но при этом снижается чувствительность теста. Растворы муравьиной кислоты, концентрация которых выше 10 %, имеют тенденцию становиться мутными при проведении теста и обычно маскируют его результаты.

Процесс декальцинации кислотными жидкостями сопровождается образованием диоксида углерода, покрывающим поверхность ткани слоем пузырьков. Они рассеиваются при встряхивании и образуются вновь до тех пор, пока в ткани присутствует карбонат кальция. Предлагалось использовать этот показатель для оценки степени декальцинации, однако карбонат кальция составляет только 4—5 % от общего количества всех минералов кости, поэтому прекращение образования пузырьков углекислого газа не может быть надежным признаком полной декальцинации.

---

Несомненно, наиболее эффективным методом обнаружения кальция в ткани является рентгенография. С помощью стандартной клинической рентгенологической установки можно одномоментно исследовать несколько образцов.

Подрезание декальцинированного материала

Особым (завершающим) этапом декальцинации является так называемое подрезание материала, т.е. окончательное моделирование кусочка кости перед его заливкой в избранную среду.

Необходимость в этом этапе бывает вызвана тем, что на поверхности кусочка кости (особенно губчатой) после пребывания его в кислотном декальцинаторе образуется слои (налет) жира костного мозга, содержащий костные крошки и нередко деревянные опилки. Налет жира удаляют, но при этом кусочек уменьшается в размерах, что нужно иметь в виду еще при выпиливании образца. При работе с крупным фрагментом кости (изготовление гистотопограмм) моделирование позволяет одновременно проверить полноту и качество декальцинации, избежать порчи микротомного ножа и получить качественные срезы. В случае неполной декальцинации ее приходится продолжить, таким образом, подрезание может быть неоднократным.

Проводят моделирование любым остро заточенным лезвием. Для этой цели пригодны скальпель, малый секционный нож, однако лучше использовать опасную бритву или лезвие безопасной бритвы, фиксированное в хирургическом иглодержателе. Опасная бритва имеет наиболее подходящий (не клиновидный, как у ножа или скальпеля) профиль и легко может быть заточен на специальном мягком бруске или мелкозернистой наждачной бумаге. С помощью опасной бритвы можно помучить очень ровную поверхность, подлежащую резке на микротоме, и не раскрошить при этом кость.

Следует заметить, что для качественного подрезания необходимо иметь используемый только для этой цели инструмент. Его нужно постоянно затачивать (особенно, если это нож или скальпель) и тщательно мыть после работы, так как металлическое лезвие портится от действия кислот при кислотной кальцинации), следы которых сохраняются в кусочке кости даже после тщательного промывания.

---

5.3 Последующая обработка материала

В большинстве случаев в кусочках ткани, прошедших кислотную декальцинацию, всегда содержится то или иное количестве кислоты. Перед переносом кусочков во вторичный фиксат или первую дегидрирующую жидкость остатки кислоты обычно удаляют путем быстрого ополаскивания в проточной воде или с помощью промокания. После кислотной декальцинации целесообразнее использовать различные нейтрализующие средства, включая промывание в проточной воде или других бол щелочных растворах, что предотвращает загрязнение дегидратирующей жидкости. Перед дегидратацией также рекомендуется промывание материала в 2 сменах 70 % спирта в течение 12 18 ч.

Для получения замороженных срезов декальцинированную ткань предварительно промывают в воде или хранят в растворе формалина, что исключает коррозию металла, из которого изготовлен нож, под воздействием кислоты, которая обычно остается в ткани.

Декальцинированные в концентрированном нейтральном растворе ЭДТА ткани не помещают в 70 % этиловый спирт, так как это вызывает образование преципитатов в виде кристаллической корки из остатков ЭДТА и спирта.

При наличии не полностью обызвествленной ткани или в случаях, когда минеральные включения в ткани препятствуют получению удовлетворительных срезов, проводят поверхностную декальцинацию. Минеральные включения выявляют по грубой (предварительной) резки ткани. В этих случаях, залив в парафин, кусочек обычно помещают на 15—60 мин в 1 % ную кислоту так, чтобы кислота соприкасалась только с той поверхностью блока, которую предстоит резать. Поскольку проникновение кислоты внутрь образца незначительное, блок должен быть тщательно ориентирован в микротоме во избежании потери декальцинированных срезов.

5.4 Заливка декальценированного материала

Для приготовления гистологических препаратов декальцинированной костной ткани объект необходимо заключить в пластическую массу, способную полностью пропитать его и обеспечить консистенцию, позволяющую получать тонкие срезы. С этой целью используют заливку в парафин, целлоидин, целлоидинпарафин.

Заливка в парафин

Для маленьких кусочков декальцинированной костной ткани вполне пригодна обычная заливка в парафин по общепринятой методике. В качестве просветляющего агента используют хлороформ, который хорошо растворяет парафин (поэтому его применяют как промежуточную среду между обезвоживанием и заливкой тканей). С целью более качественного пропитывания костной ткани парафином заливку желательно осуществлять в вакууме.

---

Т.П. Виноградова (1973) предложила метод ускоренной парафиновой заливки, используемый в отдельных случаях для материала, полученного при аспирации или пункции.

1. Материал фиксируют в 10 % нейтральном формалине 1— 3ч.

2. В случае необходимости проводят декальцинацию от 1 — 2 ч до 1 сут с последующим промыванием.

3. Переносят в 95 % этиловый спирт — 2 смены по 30 мин.

4. Проводят через 100 % спирт — 2 смены по 30 мин.

5. Помещают в бензол на ЗО мин.

6. Заливают в парафин при 52—58 °С на 30 мин.

Метод двойной целлоидинпарафиновой заливки

Этот метод обладает достоинствами парафиновой и целлоидиновой заливок. В срезах образцов, залитых с помощью этого метода, ткани различной плотности (кость, хрящ и прилежащие мягкие ткани) удерживаются вместе лучше, чем при заливке в парафин.

Методика заливки

1. Сухой целлоидин (10 г) растворяют в 1000 мл метилбензола в закрытой колбе, которую необходимо встряхивать и переворачивать 1—2 раза в день, 1—2 недели, иногда дольше.

2. Обезвоженные кусочки костной ткани помещают в полученный раствор, который меняют через 24 или 48 ч, а при обработке крупных объектов — через 72 ч. В результате образцы становятся прозрачными.

3. Кусочки переносят в бензол (3 смены по 5—7 ч в каждой), после чего проводят по общепринятой методике через смесь, состоящую из равных частей бензолпарафина и чистого парафина.

Заливка в целлоидин

Целлоидиновая заливка незаменима при изготовлении гистологических препаратов костной ткани. Целлоидин лучше связывает друг с другом ткани разной консистенции, чем парафин, и предотвращает их разделение во время резки. Этот способ заливки незаменим при получении гистологических срезов с больших блоков кости (гистотопограмм) и кости с прилежащими мягкими тканями. В целлоидине кость становится более гибкой и близкой по плотности к заливочной среде. Корковое вещество кости меньше твердеет, чем при заливке в парафин. Для целлоидиновых срезов более пригодны некоторые методы окраски (например, метод выявления канальцев), кроме того, отдельные компоненты кости, такие как линии склеивания, выявляются несколько лучше.

Целлоидиновая заливка имеет и недостатки. Так, изза относительно большой толщины получаемых срезов (10—20 мкм) затруднено изучение деталей клеток; возникают сложности при изготовлении больших и серийных срезов, их

---

наклеивании на стекла; вследствие значительной продолжительности получения целлоидиновых срезов не всегда возможно их использование при исследованиях, проводимых с диагностической целью.

Заменителем целлоидина может быть ацетилцеллюлоза, получаемая из негорючей кинопленки и рентгеновской пленки. Обработку и заливку кости в целлоидин проводят так же, как и мягких тканей, но заливочная среда должна быть более твёрдой. Некоторые исследователи предпочитают целлоидину низковязкую нитроцеллюлозу, увеличивая тем самым твердость заливочной среды.

6. Приготовление гистотопографических препаратов

В практической и научной работе исследователей, специализирующихся в области костной патологии, часто возникает необходимость в сопоставлении тех или иных особенностей структуры костной ткани в отдаленных друг от друга участках. Эту возможность предоставляют гистотопографические (кристеллеровские) обзорные препараты. С их помощью можно оценить распространенность и выраженность патологического процесса в пределах всего или большей части органа, в связи, с чем легче сопоставить патоморфологические и клинические проявления болезни.

Для приготовления гистотопографических срезов вырезают сравнительно тонкие (0,7—1 см) пластинки кости. Их последующая обработка включает:

фиксацию в нейтральном формалине —4—6 сут;

декальцинацию —4—5 сут;

подрезание материала, обычно с последующей дофиксацией в растворе формалина — 2 сут и дополнительной декальцинацией — 1—2 сут;

промывание в проточной воде 1 сут;

проводку по спиртам восходящей концентрации (70 %, %, 96%, 100%)— в каждом спирте не менее 3 сут;

проводку через смесь спирта с эфиром (1:1) — 3—5 сут. две смены жидкого целлоидина (в 1й не менее 10 сут, во 2й — не менее 5 сут), густой целлоидин — не менее 5 сут.

Пропитанный целлоидином материал наклеивают на большие деревянные блоки. Срезы готовят на санном микротоме, окрашивают обычными способами.

7. Окрашивание срезов декальценированной кости

Наиболее распространенный метод окрашивания срезов декальцинированной костной ткани — по Шморлю (тионинпикриновая кислота). Рабочие растворы: А — насыщенный раствор тионина в 50% спирте, Б— 1% водный раствор фенола, В — насыщенный раствор пикриновой кислоты.

---