Файл: Особенности приготовления.docx

Жидкость Рихмана—Гельфанда—Хилла. Данную смесь готовят из следующих компонентов: 90 % муравьиной кислоты (100 мл), 38,8 % соляной кислоты (плотность 1,19—80 мл), дистиллированной воды (820 мл). Кусочки костной ткани декальцинируют в этой смеси 1—5 дней при 20 °С и за 6—24 ч при 37 °С.

Жидкость Гудинга—Стеварта. Эта смесь состоит из 25 мл концентрированной муравьиной кислоты, 75 мл дистиллированной воды и 5 мл 40 % формальдегида. Декальцинация в этой смеси продолжается от 1 до 7 сут.

Флороглуциназотная кислота. Эта жидкость позволяет проводить быструю декальцинацию — в течение нескольких часов. Однако для тонких гистологических исследовании предпочтительнее декальцинация в жидкости Гудинга—Стеварта. Кусочки костной ткани помещают в большой объём декальцинирующей жидкости, которую готовят следующим образом: в фарфоровой чашке к 1 г флороглуцина медленно добавляют 10 мл концентрированной азотной кислоте. После прекращения кипения в чашку добавляют еще 100 мл 10 % азотной кислоте. Первоначально декальцинирующая жидкость имеет темно-красный цвет, но через несколько дней после приготовления становится желтой, что не свидетельствует о снижении ее эффективности. Флороглуцин защищает ткань от набухания и мацерации, которые наблюдаются при действии кислот.

Жидкость Дженкинса. Смесь состоит из 4 мл концентрированной соляной кислоты,, 3 мл ледяной уксусной кислоты, 1 мл дистиллированной воды, 73 мл 100 % спирта и 10 мл хлороформа. Кусочки костной ткани декальцинируют в этом растворе 2—4 сут при 20 °С. После декальцинации материал промывают в двух сменах 100 % спирта по 4 ч в каждой. Перед заливкой в парафин или целлоидин спирт удаляют в двух сменах хлороформа по 3 мин в каждой. После декальцинации в этом растворе не происходит набухания коллагеновых волокон, срезы костной ткани хорошо окрашиваются.

При проведении декальцинации в кислотных растворах крышку банки, в которой находится декальцинирующая жидкость, необходимо держать слегка приоткрытои, что способствует улетучиванию углекислого газа. Удалять образцы из кислотных растворов необходимо сразу после прекращения формирования в жидкости пузырьков углекислоты. Чрезмерно длительное пребывание образцов костной ткани в кислотных растворах нежелательно, так как при атом ухудшается качество окраски срезов.

Бескислотная декальцинация

Бескислотные методы декальцинации возникли как альтернатива кислотной декальцинации, которая имеет ряд недостатков: повреждающее действие кислотных растворов на клеточные структуры, особенно при передержке в них материала; набухание межклеточного матрикса, в частности коллагеновых волокон; инактивация многих ферментов, в связи с чем почти невозможно проводить гистохимические и гистоэнзиматические исследования.

---

Бескислотная декальцинация солями этилендиаминотетрауксусной кислоты -ЭДТА

Бескислотная декальцинация рекомендуется в случае необходимости проведения гистохимических исследовании костных образцов. эДТА и ее натриевые соли (версен, секвестрен, трилон Б, комплексон-ІІІ и др.) относятся к хелатообразующим агентам и имеют замечательное свойство: их раствор в комбинации с ионами кальция формируют легко растворимые отрицательно заряженные комплексы кальция. При декальцинации в растворах эДТА не образуются пузыри газа, вследствие чего не повреждаются ткани. Использование эДТА и ее солеи предотвращает нарушение окрашивания срезов декальцинированных костных образцов.

ЭДТА и ее соли рекомендуют использовать для декальцинации зубов и костей. Они с успехом могут быть применены для изучения щелочной фосфатазы и других ферментов (которые разрушаются в кислой среде при декальцинации), так как ЭДТА можно использовать при нейтральном рН.

ЭДТА и ее соли обычно используют в виде 5— 10 % водного раствора. Декальцинация проходит быстрее при ежедневной смене раствора. Щелочные растворы в некоторой степени гидролизуют белки, поэтому рекомендуется применять растворы ЭДТА и ее солеи в пределах рН 6,5—7,5. Губчатая кость в этих растворах декальцинируется в течение 3—7 сут, компактная кость — намного дольше. На 1 г ткани необходимо брать приблизительно 100 мл декальцинирующей жидкости. После декальцинации кусочки тщательно промывают в проточной воде. Завершенность декальцинации чаще всего оценивают с помощью иголочного теста.

Приводим несколько известных методов бескислотной декальцинации хелатообразующими агентами.

Декальцинация версеном по Хиллеману—Ли. Смесь состоит из 5,5 % раствора версена, приготовленного на 10 % растворе формалина. Перед декальцинацией образцы в течение 24 ч фиксируют в нейтральном формалине. Декальцинирующий раствор обновляют каждые 10 сут. По наблюдению авторов, декальцинация большеберцовой кости крысы занимает в среднем 4 нед.

Декальцинация ЭДТА по Фреиману. Декальцинирующая жидкость представляет собой 5 % водный раствор ЭДТА, рН которого доведен с помощью гидроксида натрия до 6,0—6,5. Материал фиксируют в 80 % спирте в течение 24 ч при 4 °С, затем промывают проточной водой. Декальцинацию в первые 24 ч проводят при 4 °С, затем раствор заменяют и декальцинация продолжается при комнатной температуре в течение 2—21 сут. Раствор рекомендуют менять через равные промежутки времени.

Декальцинация трилоном Б. Декальцинирующий раствор состоит из 250 г трилона Б, 50 мл 40 % раствора гидроксида натрия и 1000 мл дистиллированной воды. В процессе приготовления раствора соблюдают следующую последовательность: 250 г трилона Б высыпают в огнеупорную стеклянную колбу, добавляют 200 мл дистиллированной воды,

---

ставят колбу на пламя газовой горелки, добавляют 50 мл 40 % раствора гидроксила натрия, тщательно размешивают. Затем, не прекращая размешивания, добавляют 750—800 мл дистиллированной воды. С помощью 40 % раствора гидроксида натрия доводят рН до 7,4. Подогревание прекращают после полного растворения трилона Б. Повторно измеряют рН, добавляя при необходимости 40 % раствор гидроксида натрия.

Декальцинацию нежных образцов ткани, таких как улитка костного лабиринта пирамиды височной кости, желательно проводить после их заливки в целлоидин. Целлоидиновые блоки помещают в 3—5 % раствор азотной кислоты. После завершения декальцинации образцы в течение 24 ч обрабатывают 5 % водным раствором сульфата лития или натрия. Затем материал в течение 24 ч промывают в проточной воде с последующим обезвоживанием в спирте восходящих концентрации.

Критериями хорошей декальцинации костной ткани являются: 1) полное удаление солеи кальция; 2) отсутствие в изучаемых срезах признаков разрушения клеток и соединительнотканных волокон; 3) отсутствие отрицательного влияния декальцинации на процессы окрашивания срезов костной ткани.

Факторы, влияющие на продолжительность декальцинации

На продолжительность действия декальцинирующих растворов влияют несколько факторов. Два из них являются бесспорными и важными:

1) концентрация и пригодность активного агента;

2) температура, при которой протекает процессе декальцинации.

Концентрация активного агента. Применение различных добавок, особенно буферов, защищающих ткани от повреждения, приводит к увеличению продолжительности декальцинации. В пределах определенных ограничении более концентрированные растворы реагентов (особенно водные растворы кислот) действуют быстрее, но более вредны для обрабатываемых тканей. Известно, что в 4 н. растворе муравьиной кислоты декальцинация происходит вдвое быстрее, чем в ином растворе, но 1 н. растворы соляной и трихлоруксусной кислот более эффективны, чем 4 н. Установление оптимальной концентрации активных реагентов является компромиссом, позволяющим добиться баланса между желаемым результатом декальцинации и нежелательным повреждающим действием на ткани.

Во всех случаях необходимо исключить значительное истощение активного декальцинирующего агента при его взаимодействии с кальцием. Поэтому важно, чтобы соотношение объемов декальцинирующей жидкости и обрабатываемой ткани было не менее чем 20:1, причем жидкость необходимо периодически менять. Некоторые авторы рекомендуют другое соотношение -100 мл реагента на 1 г ткани при необязательной смене декальцинирующей жидкости. Но некоторое истощение декальцинирующей жидкости тем не менее происходит, поэтому следует проводить смену сильных кислот 2—3 раза в течение 24 ч, слабых кислот ежедневно, а ЭДТА — 1 раз в неделю.

---

Температура. При увеличении температуры ускоряются многие химические реакции, включая декальцинацию костного материала, но при этом усиливается воздействие кислот на обрабатываемую ткань. Так, при температуре 60 °С кость может полностью мацерироваться почти так же быстро, как декальцинироваться.

Оптимальная температура для кислотной декальцинации не установлена. Однако в большинстве случаев декальцинацию проводят при температуре рабочей лаборатории, хотя некоторые авторы предлагают считать стандартной температуру 25 °С. В то же время при низкой температуре реакции замедляются, в связи с чем материал, декальцинируемый в конце рабочей недели, можно оставить в кислоте при 4 °С на 2—3 дня. Особенно это полезно при использовании муравьиной кислоты.

Увеличение температуры также ускоряет декальцинацию, проводимую с помощью ЭДТА, но без риска мацерации. Обычно не определяются повреждения материала, декальцинированного с помощью ЭДТА при 60 °С при условии, что ткань была хорошо фиксирована.

Размешивание декальцинирующей жидкости. Вопрос о влиянии размешивания декальцинирующей жидкости на декальцинацию костной ткани спорные. В проведенных исследованиях не удалось подтвердить влияние этого фактора на продолжительность декальцинации костной ткани. Вместе с тем большинство авторов рекомендуют перемешивать декальцинирующий раствор 1—2 раза в день.

Подвешивание декальцинируемого материала. Декальцинирующая жидкость должна свободно соприкасаться со всеми поверхностями ткани. Дно посуды, в которой находится декальцинирующий раствор, обычно покрывают стеклянной ватой или любым другим инертным абсорбирующим материалом. Кусочки ткани подвешивают на нитке, что обеспечивает смачивание объекта декальцинирующей жидкостью со всех сторон. Желательно выполнять эту процедуру, так как даже при небольшом количестве образцов может стать невозможным проход между ними декальцинирующей жидкости, в результате чего увеличится продолжительность декальцинации.

Ионообменные смолы. L.W.DOTTI и соавт. (1951) описали метод использования ионообменных смол для ускорения декальцинации костной ткани, основанными на удалении из раствора свободного кальция. Результаты сравнивались с данными, полученными при использовании 13 % раствора цитрата натрия в 45 % муравьиной кислоте. Установлено, что декальцинация с помощью ионообменной смолы происходит быстрее, чем в контроле. При этом обеспечивается высокая сохранность тканей клеточных деталей (кроме случаев, когда концентрация муравьиной кислоты превышала 50 %).

---

Электролиз. С целью ускорения декальцинации І.М. Кіcb-пап й соавт. (1947) разработали электролитический метод. При этом кость прикрепляют к аноду, электрический ток, проходя через раствор электролита, способствует миграции ионов кальция к катоду и тем самым вызывает деминерализацию кости. В качестве электролитов были испытаны разные растворы. Наиболее зффективной сказалась смесь 8 % соляной и 10 % муравьиной кислот (они сами по себе обладают выраженным декальцинирующим свойством), декальцинирующая костные образцы в течение 2—6 ч. Декальцинацию проводили при температуре от ЗО до 45 °С, но на аноде она была определенно выше.

Другие авторы, используя подобную аппаратуру и схожие растворы, обнаружили, что продолжительность декальцинации костных образцов составляет 15—20 ч. Более того, Е.С. Сіау-Іеn (1952) показал, что электролитическийq метод cспособствует незначительному ускорению декальцинации. Существенным недостатком этого метода декальцинации является риск повреждения (ожог, набухание или гидролиз) или деструкции ткани при ее контакте с электродом.

Ультразвук. Е.З. Тbогре и соавт. (1963) предложили использовать для декальцинации кости ультразвуковой генератор. Они сообщили о десятикратном увеличении скорости декальцинации) без ущерба для структуры ткани и ее окраски в результате применения генератора с частотой 10,25 кГц и 7,5 % раствора уксусной кислоты. Однако другим авторам, повторившим подобные эксперименты, не удалось подтвердить эти данные. В среде, подвергающейся воздействию ультразвука, температура повышается до )6 °С, что, вероятно, является единственным фактором, ускоряющим процесс декальцинации [Ра§е К.М., 1977]. Кроме того, ультразвук дает деструктивный эффект и вряд ли может быть широко использован как метод декальцинации.

Завершение декальцинации

При наиболее оптимальном варианте ткань необходимо извлекать из декальцинирующей жидкости немедленно после того, как из кости удалены последние следы минералов. Для этого необходимо постоянно наблюдать за ходом декальцинации. В отдельных случаях допускается некоторая передекальцинация материала. При атом материал окрашивают так же, как и костный образец, в котором сохраняются последние остатки минералов.

Контроль за ходом декальцинации осуществляют в сочетании с заменой декальцинирующей жидкости. При использовании в качестве декальцинаторов слабых кислот тестирование на завершение декальцинации обычно проводят ежедневно, при проведении декальцинации с помощью ЭДТА — еженедельно. Тестирование образцов костной ткани с небольшим содержанием минералов, декальцинацию которых осуществляют с помощью сильных кислот, проводится однократно для оценки полной декальцинации материала. В тех случаях, когда обработку материала осуществляют в условиях значительного дефицита времени, допускается его неполная декальцинация.

---