ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 09.11.2023
Просмотров: 283
Скачиваний: 2
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
СОДЕРЖАНИЕ
1. Объекты и методы изучения в гистологии
3. Приготовление серии парафиновых срезов
5. Особенности приготовления гистологических препаратов из костной ткани
5.2 Декальцинация костного материала
5.3 Последующая обработка материала
5.4 Заливка декальценированного материала
6. Приготовление гистотопографических препаратов
Окраску производят следующим образом.
. Срезы интенсивно окрашивают гематоксилином (лучше гематоксилин Вейгерта) и споласкивают в воде.
. Сразу переносят в пикрофуксин на 3-5 мин (смесь насыщенного водного раствора пикриновой кислоты - 150,0 и насыщенного водного раствора кислого фуксина -3,0-5,0).
. Быстро промывают в воде (вода извлекает из среза фуксин).
. Обезвоживают 95° спиртом 1-2 мин.
. Просветляют в карболксилоле и заключают в пихтовый бальзам, как при окраске гематоксилин-эозином.
Окраска Суданом III. Судан III - нейтральная азокраска, растворимая в спирте, ацетоне и жирах, не растворимая в воде. Окраску Суданом III производят для определения в срезах жиров и липидов. Техника окраски следующая.
. Замороженные срезы переносят изводы на 0,5- 1 мин в 50° спирт.
. Срезы помещают в свежефильтрованный раствор Судана на 10-20 мин.
. Споласкивают 50° спиртом в течение 0,5-1 мин.
. Тщательно промывают водой в течение 10 - 15 мин.
. Срезы подкрашивают квасцовым гематоксилином Эрлиха или Бемера.
. Промывают водой в течение 3-5 мин. Перекрашенные в гематоксилине срезы дифференцируют в 1%-ном водном растворе соляной кислоты, споласкивают подщелоченной водой, затем чистои водой.
. Заключают в глицерин или глицерин-желатину.
. Накрывают покровным стеклом.
Гистологический препарат любой формы должен отвечать следующим требованиям:
1. Сохранять прижизненное состояние структур;
. Быть достаточно тонким и прозрачным. Для изучения его под микроскопом в проходящем свете.
. Быть контрастным, то есть изучаемые структуры должны под микроскопом четко определяться;
. Препараты для световой микроскопии должны долго сохраняться и использоваться для повторного изучения.
Эти требования достигаются при качественном приготовлении препарата. Основным методом исследования биологических объектов, используемым в гистологии является микроскопирование (то есть изучение препаратов под микроскопом).
Для того что бы получить хорошие гистологические срезы, необходимо уметь своевременно распознать и устранить причину, ухудшающую качество среза.
а) Срез крошится.
Причины:
Устранение:
б) Залитый материал в процессе резки выпадает из окружающей массы парафина.
Причины:
Устранение:
в) Плоскость среза неровная, материал плохо режется или совсем не режется, нож подскакивает над поверхностью блока.
Причина:
Устранение:
Невозможно. Можно лишь несколько размягчить материал, если на поверхность резания перед каждым движением ножа наносить слои горячего парафина кисточкой (дав ему затем остыть) или дышать на поверхность блока.
г) Срезы закручиваются, прилипают к поверхности ножа, мнутся.
Причины:
Устранение:
Устранение:
е) Срезы разрываются или покрыты бороздами.
Причины:
Устранение:
ж) Плоскость среза не однородна (беловатая в средней части).
Причина:
Устранение:
При серийном исследовании материала, залитого в парафин, удобнее всего пользоваться лентами из срезов. Однако добиваться получения таких лент всегда легко. Для достижения хороших результатов необходимо соблюдать следующие основные условия:
Парафин должен быть хорошего качества с температурой плавления 48-520С, достаточно пластичным, а заключение материала в него безукоризненным. Невозможно получение лент при слишком плотных и больших объектах.
Нож должен быть хорошо заточен и установлен поперечно.
Парафиновому блоку придают строго прямоугольную форму, длинник его устанавливают параллельно длиннику микротома. Одновременно следят за тем, чтобы узкая сторона блока, обращенная к лезвию ножа, была тоже параллельна последнему. Режущий край ножа, будучи подведен к блоку, должен прилегать ко всеи его стороне.
Желательная толщина срезов 7-8 мкм. Слишком тонкие и толстые срезы малопригодны. Резку ведут толчкообразным движениями ножа.
В лабораторном помещении желательна температура около 18-220С. При более низкой температуре необходимо поставить около микротома (вблизи блока) включенную электроплиту. Наоборот, при слишком высокой температуре парафин становится мягким, срезы легко мнутся, в таком случае блок охлаждают льдом.
В процессе резания срезы накапливаются на верхней поверхности ножа, по мере накопления их отодвигают по ножу кверху, свешивая если нужно. По получении лент нужной длины их осторожно снимают, пользуясь препаровальной иглой, и кисточкой и опускают в воду. Затем срезы забирают и наклеивают на стекла.
Надписи на предметных стеклах делают ручкои с пером черной тушью.
Перед тем как приступить к окрашиванию срезов, их, как правило, подвергают специальной предварительной обработке. Парафиновые срезы требуют наиболее сложной подготовки. Так как парафин не обладает достаточной прозрачностью и затрудняет процесс окрашивания (гистологические красители - это водные или спиртовые растворы, плохо проникающие в парафинированные ткани), его необходимо удалить из среза. Для этого срез подвергают депарафинированию - процессу, обратному тому, который осуществляют при подготовке объекта к заливке парафин, Т. е. срезы последовательно проводят через растворитель парафина, спирты нисходящей концентрации и помещают в воду. Практически это осуществляют так: этикетируют высокие стаканчики, наливают в них соответствующие растворы и устанавливают в определенной последовательности, обеспечивающей проведение манипуляции по следующей схеме:
Ксилол (толуол, бензол) две смены по 2-4 мин.
Спирт 960 2-3 мин.
Спирт 800 2-3 мин.
Вода дистиллированная 2 мин. и больше.
Первый этап обработки кусочков кости — фиксация, цель которой: закрепить структуру костной ткани в том состоянии, в каком она находилась в момент ее погружения в фиксирующую жидкость; предохранить ее от дальнейшего разрушения; подготовить костную ткань к последующей обработке.
Для фиксации костной ткани наиболее пригодны фиксирующие жидкости, содержащие формалин, так как при последующеи декальцинации меньше набухает ткань, содержащая коллаген. С целью выявления извести (солеи кальция) в костной ткани в качестве фиксатора чаще всего используют этиловый спирт. Формалин, смеси с пикриновой кислотой и фиксаторы, содержащие трихлоруксусную и уксусную кислоты, обладают слабовыраженными декальцинирующими свойствами, что важно учитывать при фиксации кусочков костной ткани.
Продолжительность фиксации в каждом фиксаторе можно указать только примерно. Надрезая острой бритвой толстые куски фиксируемой ткани, по изменению окраски и плотности ткани можно удостовериться, полностью ли проник фиксатор в ткань. Не следует передерживать объекты в фиксаторах. Только в 10 % формалине и смеси Буэна кусочки костной ткани можно хранить неограниченно долго.
При работе с любыми фиксирующими жидкостями необходимо соблюдать общие правила фиксации.
Для фиксации костного материала используют формалин, этиловый спирт, спирт-формол, жидкости Карнуа и др.
Формалин. Обычно используют:
10% раствор формалина, состоящий из 10 мл 40 % раствора формальдегида и 90 мл водопроводной воды;
концентрированный нейтральный формалин, из 100 мл формалина и 10г мела или карбоната магния основного;
10 % нейтральный формалин, состоящий из 10 мл концентрированного нейтрального формалина в 90 мл водопроводной воды;
хорошо зарекомендовал себя 5% раствор формальдегида на изотоническом растворе хлорида натрия.
Кусочки костной ткани фиксируют в течение 24—48 ч в хорошо укупоренной банке (материал в формалине может сохраняться годами), затем промывают в проточной воде (луч 2 сут) и проводят через спирты возрастающей концентрации.
. Срезы интенсивно окрашивают гематоксилином (лучше гематоксилин Вейгерта) и споласкивают в воде.
. Сразу переносят в пикрофуксин на 3-5 мин (смесь насыщенного водного раствора пикриновой кислоты - 150,0 и насыщенного водного раствора кислого фуксина -3,0-5,0).
. Быстро промывают в воде (вода извлекает из среза фуксин).
. Обезвоживают 95° спиртом 1-2 мин.
. Просветляют в карболксилоле и заключают в пихтовый бальзам, как при окраске гематоксилин-эозином.
Окраска Суданом III. Судан III - нейтральная азокраска, растворимая в спирте, ацетоне и жирах, не растворимая в воде. Окраску Суданом III производят для определения в срезах жиров и липидов. Техника окраски следующая.
. Замороженные срезы переносят изводы на 0,5- 1 мин в 50° спирт.
. Срезы помещают в свежефильтрованный раствор Судана на 10-20 мин.
. Споласкивают 50° спиртом в течение 0,5-1 мин.
. Тщательно промывают водой в течение 10 - 15 мин.
. Срезы подкрашивают квасцовым гематоксилином Эрлиха или Бемера.
. Промывают водой в течение 3-5 мин. Перекрашенные в гематоксилине срезы дифференцируют в 1%-ном водном растворе соляной кислоты, споласкивают подщелоченной водой, затем чистои водой.
. Заключают в глицерин или глицерин-желатину.
. Накрывают покровным стеклом.
1.6 Контроль качества
Гистологический препарат любой формы должен отвечать следующим требованиям:
1. Сохранять прижизненное состояние структур;
. Быть достаточно тонким и прозрачным. Для изучения его под микроскопом в проходящем свете.
. Быть контрастным, то есть изучаемые структуры должны под микроскопом четко определяться;
. Препараты для световой микроскопии должны долго сохраняться и использоваться для повторного изучения.
Эти требования достигаются при качественном приготовлении препарата. Основным методом исследования биологических объектов, используемым в гистологии является микроскопирование (то есть изучение препаратов под микроскопом).
2. Возможные погрешности
Для того что бы получить хорошие гистологические срезы, необходимо уметь своевременно распознать и устранить причину, ухудшающую качество среза.
а) Срез крошится.
Причины:
-
твердый парафин -
низкая температура окружающей среды -
медленное охлаждение парафина при заливке -
большой угол наклона ножа
Устранение:
-
залить материал в более мягкий парафин после предварительного растапливания блока в термостате -
дышать на поверхность блока (согревание) перед каждым движением ножа или приспособить эл. плиту рядом с микротомом -
изменить угол наклона ножа.
б) Залитый материал в процессе резки выпадает из окружающей массы парафина.
Причины:
-
при переносе кусочка в формочку для заливки произошло его охлаждение.
Устранение:
-
необходимо блок растопить в термостате и залить заново, строго соблюдая правила заливки, после предварительного растапливания материал переносят в промежуточные срезы (для удаления спирта), затем вновь пропитывают и заливают -
заливка произведена охлажденным парафином -
недостаточное удаление спирта перед пропитыванием.
в) Плоскость среза неровная, материал плохо режется или совсем не режется, нож подскакивает над поверхностью блока.
Причина:
-
переутомление материала при проводке и фиксации.
Устранение:
Невозможно. Можно лишь несколько размягчить материал, если на поверхность резания перед каждым движением ножа наносить слои горячего парафина кисточкой (дав ему затем остыть) или дышать на поверхность блока.
г) Срезы закручиваются, прилипают к поверхности ножа, мнутся.
Причины:
-
малый угол наклона ножа -
мягкий парафин -
высокая температура окружающей среды.
Устранение:
-
изменить угол наклона -
залить материал в более твердый парафин и охладить блок путем помещения перед резкой в холодильник (можно также положить на поверхность резание кусочек льда) -
приклеивание, сморщивание или разрыв срезов, особенно при резке органов, богатых костной , хрящевой или плотной соединительной ткани, могут быть следствием их электризации.
Устранение:
-
помещать на лезвие (в месте прохождения среза) каплю воды, дышать на лезвие и блок, натирать участок лезвия и прилежащую часть ножа куском твердого парафина.
е) Срезы разрываются или покрыты бороздами.
Причины:
-
зазубрины на лезвии ножа -
грязный парафин (плотные соринки царапают срез и портят лезвие); -
материал плохо декальцинирован.
Устранение:
-
точка и правка ножа или перемещение в ножедержателе -
перезаливка в чистый парафин -
устранить нельзя.
ж) Плоскость среза не однородна (беловатая в средней части).
Причина:
-
Недостаточное обезвоживание.
Устранение:
-
Расплавление блока и проведение материала через промежуточные срезы до абсолютного спирта. После обезвоживания проводят через промежуточную среду, пропитывают и заливают.
3. Приготовление серии парафиновых срезов
При серийном исследовании материала, залитого в парафин, удобнее всего пользоваться лентами из срезов. Однако добиваться получения таких лент всегда легко. Для достижения хороших результатов необходимо соблюдать следующие основные условия:
Парафин должен быть хорошего качества с температурой плавления 48-520С, достаточно пластичным, а заключение материала в него безукоризненным. Невозможно получение лент при слишком плотных и больших объектах.
Нож должен быть хорошо заточен и установлен поперечно.
Парафиновому блоку придают строго прямоугольную форму, длинник его устанавливают параллельно длиннику микротома. Одновременно следят за тем, чтобы узкая сторона блока, обращенная к лезвию ножа, была тоже параллельна последнему. Режущий край ножа, будучи подведен к блоку, должен прилегать ко всеи его стороне.
Желательная толщина срезов 7-8 мкм. Слишком тонкие и толстые срезы малопригодны. Резку ведут толчкообразным движениями ножа.
В лабораторном помещении желательна температура около 18-220С. При более низкой температуре необходимо поставить около микротома (вблизи блока) включенную электроплиту. Наоборот, при слишком высокой температуре парафин становится мягким, срезы легко мнутся, в таком случае блок охлаждают льдом.
В процессе резания срезы накапливаются на верхней поверхности ножа, по мере накопления их отодвигают по ножу кверху, свешивая если нужно. По получении лент нужной длины их осторожно снимают, пользуясь препаровальной иглой, и кисточкой и опускают в воду. Затем срезы забирают и наклеивают на стекла.
Надписи на предметных стеклах делают ручкои с пером черной тушью.
4. Депарафинирование
Перед тем как приступить к окрашиванию срезов, их, как правило, подвергают специальной предварительной обработке. Парафиновые срезы требуют наиболее сложной подготовки. Так как парафин не обладает достаточной прозрачностью и затрудняет процесс окрашивания (гистологические красители - это водные или спиртовые растворы, плохо проникающие в парафинированные ткани), его необходимо удалить из среза. Для этого срез подвергают депарафинированию - процессу, обратному тому, который осуществляют при подготовке объекта к заливке парафин, Т. е. срезы последовательно проводят через растворитель парафина, спирты нисходящей концентрации и помещают в воду. Практически это осуществляют так: этикетируют высокие стаканчики, наливают в них соответствующие растворы и устанавливают в определенной последовательности, обеспечивающей проведение манипуляции по следующей схеме:
Ксилол (толуол, бензол) две смены по 2-4 мин.
Спирт 960 2-3 мин.
Спирт 800 2-3 мин.
Вода дистиллированная 2 мин. и больше.
5. Особенности приготовления гистологических препаратов из костной ткани
Первый этап обработки кусочков кости — фиксация, цель которой: закрепить структуру костной ткани в том состоянии, в каком она находилась в момент ее погружения в фиксирующую жидкость; предохранить ее от дальнейшего разрушения; подготовить костную ткань к последующей обработке.
Для фиксации костной ткани наиболее пригодны фиксирующие жидкости, содержащие формалин, так как при последующеи декальцинации меньше набухает ткань, содержащая коллаген. С целью выявления извести (солеи кальция) в костной ткани в качестве фиксатора чаще всего используют этиловый спирт. Формалин, смеси с пикриновой кислотой и фиксаторы, содержащие трихлоруксусную и уксусную кислоты, обладают слабовыраженными декальцинирующими свойствами, что важно учитывать при фиксации кусочков костной ткани.
Продолжительность фиксации в каждом фиксаторе можно указать только примерно. Надрезая острой бритвой толстые куски фиксируемой ткани, по изменению окраски и плотности ткани можно удостовериться, полностью ли проник фиксатор в ткань. Не следует передерживать объекты в фиксаторах. Только в 10 % формалине и смеси Буэна кусочки костной ткани можно хранить неограниченно долго.
При работе с любыми фиксирующими жидкостями необходимо соблюдать общие правила фиксации.
Для фиксации костного материала используют формалин, этиловый спирт, спирт-формол, жидкости Карнуа и др.
5.1 Материалы для фиксации
Формалин. Обычно используют:
10% раствор формалина, состоящий из 10 мл 40 % раствора формальдегида и 90 мл водопроводной воды;
концентрированный нейтральный формалин, из 100 мл формалина и 10г мела или карбоната магния основного;
10 % нейтральный формалин, состоящий из 10 мл концентрированного нейтрального формалина в 90 мл водопроводной воды;
хорошо зарекомендовал себя 5% раствор формальдегида на изотоническом растворе хлорида натрия.
Кусочки костной ткани фиксируют в течение 24—48 ч в хорошо укупоренной банке (материал в формалине может сохраняться годами), затем промывают в проточной воде (луч 2 сут) и проводят через спирты возрастающей концентрации.