Файл: Особенности приготовления.docx

---

1.3 Уплотнение

Уплотнение материала, необходимое для приготовления срезов, производится путем пропитывания предварительно обезвоженного материала парафином, целлоидином, органическими смолами. Более быстрое уплотнение достигается применением метода замораживания кусочков, например, в жидкой углекислоте

Заливка: помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин на 1-2 ч при 52-56°С. Дают парафину, остывая, затвердеть; вырезают из него блок с заключённым образцом и закрепляют на деревянном кубике. Также используют заливку в смолы, желатин и замораживание.

После окончательного пропитывания объекта его заливают расплавленным парафином, специально приготовленным для этих целей и хранящимся в термостате.

В качестве формочек для заливки используют разнообразные приспособления. Г-образные гладкие угольники изготовляют из металла (латунь, свинец, сталь). Рекомендуется применять угольники, длинная сторона которых равна 8-10 см, короткая - 3 см, высота - 1,5-2 см.

Угольники кладут на отполированную металлическую или стеклянную пластину и, сдвигая углы, создают формочку нужных размеров.

1.4 Заключение срезов

Гистологическая техника, комплекс методич. приёмов, используемых в гистологии и патол. анатомии при изготовлении препаратов клеток, тканей и органов для их последующего микроскопирования.

Приготовление постоянных гистол. препаратов в виде тонких срезов состоит из след. осн. этапов: фиксации, промывки, обезвоживания и заливки кусочков, приготовления срезов, окрашивания, обезвоживания и заключения. Фиксация - сохранение структуры и в некоторой степени химич. состава клеток и тканей путём быстрого воздействия на них химич. или физич. агентов, предотвращающих развитие посмертных изменении. Для фиксации используют р-ры формальдегида (4%-ные), глютаральдегида (2-6%-ные), фиксирующие смеси, содержащие уксусную к-ту (жидкость Карнуа), пикриновую к-ту (жидкость Буэна).

Один из лучших фиксаторов, используемый в электронномикроскопич. исследованиях, - р-р четырёхокиси осмия. При применении медленно проникающих фиксаторов (четырёхокись осмия, глютаральдегид) толщина кусочков тканей должна быть не более 2 мм. Наилучшие результаты даёт относительно длительная фиксация при

---

t 2-4°С. Обызвествлённые ткани и структуры после фиксации подвергают декальцинации - обработке к-тами (азотной, соляной и др.) или электрич. током. По окончании фиксации кусочки промывают в воде или спирте. Дальнейшая обработка заключается в придании кусочкам однородной плотной консистенции, что необходимо для получения тонких срезов. Это достигается либо путём замораживания кусочков, либо путём пропитывания - заливки их различными застывающими средами. При изготовлении срезов на замораживающем микротоме (рис. 1) замораживание объектов достигается либо жидкой углекислотой, либо с помощью термоэлектрического охлаждающего столика ТОС. В микротоме-криостате МК-25 имеется камера с низкой темп-рои, в которую заключён микротом.

Из сред для заливки чаще применяют парафин и целлоидин. При заливке в парафин отмытую от фиксатора ткань обезвоживают (через спирты возрастающей крепости), проводят через промежуточный растворитель (ксилол или хлороформ) и пропитывают парафином при t 55-56°С, затем, быстро охлаждая кусочки, получают парафиновые блоки. При заливке в целлоидин промежуточным растворителем является спирт - эфир (1:1). Для получения срезов с парафиновых и целлоидиновых блоков используют санный микротом. Окрашиванием срезов достигают контрастирования различных структур клеток и тканей, по-разному воспринимающих те или иные красители.

Окрашивают срезы после удаления из них парафина (ксилолом), проводки их через спирты понижающейся концентрации и промывания в воде. Способы окрашивания препаратов многообразны. Из основных красителей чаще используют гематоксилин, кармин, сафранин, метиловый зелёный, галлоцианин; из кислых - эозин, эритрозин, кислый фуксин, индигокармин и др. Спец. красители выделяют определённые компоненты клеток и тканей, например, слизь окрашивается муцикармином, эластич. элементы - орсеином и др. Для приготовления препаратов нервной ткани применяют суправитальную окраску метиленовым синим и различные методы импрегнации - восстановление нервными структурами металлов, гл. обр. серебра. После окраски хорошо промытые препараты обезвоживают в спиртах восходящей крепости (до 100%), просветляют в смеси карболовой к-ты и ксилола (1:3), выдерживают в 2 порциях ксилола и затем заключают в среду, обеспечивающую сохранность структур объекта, его окраску и прозрачность, применяя для этого канадский или пихтовый бальзам, полистирол и др.

---

В случаях, когда препарат нельзя приводить в контакт с ксилолом, спиртом, используют для заключения водорастворимые среды (глицерин, желатин или их смеси). Для изучения свежего материала (живых или переживающих объектов) изготовляют временные гистол. препараты, в к-рых объект заключают в физиол. р-ры. Большие возможности для прижизненного исследования клеток даёт метод культуры тканей.

---

1.5 Окрашивание

Окраска гистологических срезов основана на неодинаковом сродстве тканевых элементов к определенным красителям. Ядра клеток более способны окрашиваться основными, а цитоплазма - кислыми красками. Соответственно этому различают основные, или ядерные, и кислые, или диффузные, краски.

Наиболее часто в обычной патологоанатомической практике применяются окраски срезов гематоксилин-эозином по Ван-Гизону, Перлсу, Суданом III и др.

Окраска гематоксилин-эозином. Окрашивают срезы в маленьких чашках Петри или на стеклах. Этот метод применяется для окраски срезов, приготовленных любым способом. При этом ядра клеток приобретают фиолетово-синий или густо-синий цвет, а цитоплазма и волокнистое вещество - светло-синий или розово-красный. Жиры и липоиды не окрашиваются. Эритроциты млекопитающих, поскольку они ядер не содержат, окрашиваются только эозином.

Окраску срезов в чашках Петри производят следующим образом.

. Срез переносят препаровальной иглой из воды в раствор гематоксилина на 2-5 мин.

. Промывают в воде 2-5 мин.

. Погружают на 10-20 с в 1%-ный раствор соляной кислоты на 70° спирте (если срез сильно перекрашен гематоксилином, его следует держать в этом растворе несколько дольше).

. Промывают в чистой воде 5-10 мин.

. Промывают в слабощелочном растворе (в баночку с водой прибавляют 1-2 капли нашатырного спирта) 10 мин.

. Промывают снова чистои водой в течение 10 - 15 мин. Если срез после щелочной воды недостаточно промыт, он плохо опрашивается эозином.

. Окрашивают эозином в течение 3-5 мин.

. Промывают в течение 1-2 мин водой. 280

. Обезвоживают в спиртах восходящей крепости - 75, 90, 100°. Если срез перекрашен эозином, его следует несколько дольше держать в 75° спирте.

. Просветляют в карболксилоле.

. При помощи шпателя и иголки срез переносят на предметное стекло.

. Высушивают фильтровальной бумагой.

. На срез наносят каплю канадского или пихтового бальзама и накрывают покровным стеклом.

Окраска по Ван-Гизону. В срезах, окрашенных по Ван-Гизону, соединительная ткань красится в ярко-красный, остальные ткани - в желтый или серовато-желтый цвет. Ядра окрашиваются в черный или тёмно-фиолетовый цвет.

---