Файл: имунология и алергология.doc

Г. В большинстве клинических лабораторий для определения поверхностных антигенов лимфоцитов используют цельную кровь. Суть метода заключается в следующем: 1) к небольшому объему цельной крови добавляют меченные флюорохромом моноклональные антитела; 2) после инкубации, необходимой для связывания антител с антигенами клеточной поверхности, разрушают эритроциты; 3) с помощью проточного цитофлюориметра анализируют клеточный состав пробы.

Результаты исследования выражают в виде абсолютного и относительного числа лимфоцитов разных популяций. Оценку результатов проводят с учетом нормальных показателей, которые зависят от возраста, пола и расы. Простой способ проверки надежности результатов заключается в том, что относительное содержание основных популяций лимфоцитов (T-, B- и NK-лимфоцитов) в сумме должно составлять 100%. В норме у взрослых около 70% лимфоцитов крови составляют T-лимфоциты, при этом соотношение лимфоцитов CD4/CD8 превышает 1, как правило, оно составляет 1,5—2, остальные 30% приходятся на B- и NK-лимфоциты. В клинических лабораториях проточная цитофлюориметрия широко применяется для определения содержания лимфоцитов CD4 при ВИЧ-инфекции. Проточная цитофлюориметрия становится стандартным методом диагностики гемобластозов, поскольку позволяет определить тип и стадию дифференцировки трансформированных клеток. Этот метод применяется также для выявления других изменений клеточного состава крови и определения активированных лимфоцитов. Результаты проточной цитофлюориметрии, как правило, не позволяют поставить диагноз, но дают важную информацию для его уточнения.

III. Оценка функциональной активности лимфоцитов

А. B-лимфоциты

1. Исследование функций B-лимфоцитов in vivo

а. Исследование функций B-лимфоцитов начинают с определения уровня иммуноглобулинов в сыворотке. Для этого чаще всего применяют нефелометрию и простую радиальную иммунодиффузию. Результаты исследования оценивают с учетом возраста (см. приложения IV и V). Пол и расовая принадлежность почти не влияют на уровень иммуноглобулинов в сыворотке.

б. Для углубленной оценки гуморального иммунитета определяют уровень подклассов IgG. Хотя в большинстве случаев изменение уровня подклассов IgG не сопровождается выраженными клиническими проявлениями, у больных с рецидивирующими инфекциями относительное содержание подклассов IgG значительно отличается от нормы. При этом общий уровень IgG и других иммуноглобулинов может быть нормальным. Поскольку определение подклассов IgG — дорогостоящий метод, он применяется в редких случаях. Наряду с определением подклассов IgG при диагностике иммунодефицитов оценивают также гуморальный иммунный ответ на определенные антигены (см. гл. 20, п. III.А.1.в).

в. Определение антител к белковым и полисахаридным антигенам. Этот метод основан на определении уровня антител к белковым (например, столбнячному и дифтерийному анатоксинам) и полисахаридным (например, пневмококковой вакцине) антигенам до и после вакцинации. Он применяется лишь в специализированных лабораториях. Нарушение продукции антител к белковым и полисахаридным антигенам подтверждает недостаточность гуморального иммунитета и свидетельствует о необходимости назначения нормального иммуноглобулина для в/в введения (даже при нормальном уровне иммуноглобулинов сыворотки). Определение продукции антител к полисахаридным антигенам у детей младше 2 лет малоинформативно и обычно не проводится (см. гл. 18, пп. IV.А.2.а—б).

2. Исследование функций B-лимфоцитов in vitro. Это исследование оценивает способность B-лимфоцитов к дифференцировке в плазматические клетки и выработке ими иммуноглобулинов в ответ на неспецифический (митоген) и специфический (антиген) стимул в культуре клеток. Его обычно проводят только в научных целях.

Б. T-лимфоциты

1. Исследование функций T-лимфоцитов in vivo

а. Абсолютное число лимфоцитов. Поскольку в норме T-лимфоциты составляют около 70% всех лимфоцитов крови, существенное снижение числа T-лимфоцитов значительно больше сказывается на общем числе лимфоцитов, чем снижение B- или NK-лимфоцитов.

б. Кожные пробы позволяют оценить способность T-лимфоцитов вызывать аллергическую реакцию замедленного типа при внутрикожном введении антигена. Размеры эритемы и папулы в месте инъекции определяют через 24 и 48 ч. Поскольку отрицательная реакция может быть следствием не только нарушения иммунитета, но и отсутствия предшествующего контакта с данным антигеном, пробу проводят с набором широко распространенных антигенов, в который входят дерматофитин 0, Трихофитон, антиген вируса эпидемического паротита, очищенный туберкулин, столбнячный и дифтерийный анатоксины (см. гл. 18, п. III.Ж). Отрицательная реакция на несколько распространенных антигенов у больных с оппортунистическими инфекциями свидетельствует о выраженной недостаточности клеточного иммунитета. Важную роль в диагностике иммунодефицитов играют также данные анамнеза. Так, если в прошлом отмечался аллергический контактный дерматит (например, вызванный ядоносным сумахом), недостаточность клеточного иммунитета маловероятна.

2. Исследование функций T-лимфоцитов in vitro

а. Пролиферативную активность T-лимфоцитов оценивают по интенсивности синтеза ДНК в ответ на стимуляцию митогеном (поликлональная стимуляция) или антигеном (моно- и олигоклональная стимуляция). В последнем случае применяются распространенные антигены или аллоантигены. Интенсивность синтеза ДНК оценивают по включению в нее меченных радиоактивным изотопом нуклеозидов, например ³H-тимидина. Результаты обычно выражают в импульсах в минуту (имп/мин) и в виде индекса стимуляции — отношение радиоактивности стимулированных и нестимулированных лимфоцитов. Митогены стимулируют пролиферацию значительной части T-лимфоцитов, поэтому результат оценивают обычно через 3 сут. Антиген стимулирует пролиферацию только тех T-лимфоцитов, которые несут рецептор к нему, поэтому индуцированную антигеном пролиферацию оценивают через 5—7 сут. Для оценки пролиферативной активности T-лимфоцитов, как и при проведении кожных проб, применяют набор широко распространенных антигенов. У ВИЧ-инфицированных пролиферативная реакция T-лимфоцитов на распространенные антигены может быть снижена уже на ранних стадиях заболевания. Прогрессирование ВИЧ-инфекции и других иммунодефицитов сопровождается снижением реакции T-лимфоцитов на аллоантигены, а впоследствии — и на митогены. Отсутствие реакции на митогены свидетельствует о тяжелой недостаточности клеточного иммунитета.

б. Оценка цитотоксичности. Обычно оценивают цитотоксичность, ограниченную по HLA, опосредованную лимфоцитами CD8 (см. гл. 17, п. II.А.1.а). Клетками-мишенями служат собственные клетки, несущие на своей поверхности чужеродный антиген, связанный с антигенами HLA класса I. Лимфоциты CD8 играют важную роль в защите от вирусных инфекций. Наряду с лимфоцитами CD8 ограниченную по HLA цитотоксичность осуществляют некоторые лимфоциты CD4, распознающие антиген в комплексе с антигенами HLA класса II. Обе субпопуляции лимфоцитов несут антигенраспознающий рецептор, образованный альфа- и бета-цепями. Лимфоциты CD8 с антигенраспознающим рецептором, образованным гамма- и дельта-цепями, участвуют в цитотоксичности, не ограниченной по HLA. Эти лимфоциты присутствуют в крови в незначительном количестве и разрушают клетки-мишени подобно NK-лимфоцитам, то есть без предварительной иммунизации (см. гл. 20, п. III.B). Оценка клеточной цитотоксичности необходима для диагностики иммунодефицитов. Оценку цитотоксической активности лимфоцитов проводят следующим образом: 1) клетки-мишени обрабатывают радиоактивной меткой (⁵¹Cr); 2) к меченым клеткам-мишеням добавляют исследуемые лимфоциты; 3) гибель клеток-мишеней оценивают по выходу радиоактивной метки в раствор. Полученные результаты сравнивают с нормальными показателями. При исследовании ограниченной по HLA цитотоксичности исследуемые T-лимфоциты предварительно инкубируют с антигеном, присутствующим на клетках-мишенях.

в. Исследование цитокинов. Активированные лимфоциты вырабатывают биологически активные вещества — цитокины (см. гл. 1, п. IV.Б). Их уровень определяют с помощью готовых наборов для РИА и твердофазного ИФА. Существуют и более трудоемкие методы исследования цитокинов, основанные на оценке их биологических функций. Оценить содержание цитокинов in vivo довольно сложно, поскольку они прочно связаны с клеточными рецепторами, а в сыворотке и других биологических жидкостях быстро разрушаются.

В. Исследование функций NK-лимфоцитов

1. Цитотоксичность NK-лимфоцитов не зависит от предварительной иммунизации и не ограничена по HLA. Цитотоксическую активность NK-лимфоцитов оценивают с помощью метода, описанного в гл. 20, п. III.Б.2.б, используя в качестве клеток-мишеней разные линии трансформированных клеток, чувствительных к действию NK-лимфоцитов. Разрушение клеток-мишеней осуществляется лишь при образовании тесного контакта с NK-лимфоцитами. Этот контакт может быть прямым или опосредованным, при котором NK-лимфоциты прикрепляются к покрытым IgG клеткам-мишеням через рецептор к Fc-фрагменту IgG — антителозависимая клеточная цитотоксичность. Благодаря этому механизму могут быть разрушены клетки-мишени, первоначально устойчивые к действию NK-лимфоцитов. Антителозависимую клеточную цитотоксичность оценивают с помощью стандартного метода (см. гл. 20, п. III.Б.2.б), используя клетки-мишени, покрытые антителами класса IgG. NK-лимфоциты играют важную роль в противовирусном и противоопухолевом иммунитете и участвуют в отторжении трансплантата. Снижение цитотоксической активности NK-лимфоцитов выявляется при многих заболеваниях, в том числе при злокачественных новообразованиях, а отсутствие наблюдается крайне редко.

2. Активация NK-лимфоцитов цитокинами. После инкубации с определенными цитокинами цитотоксическая активность NK-лимфоцитов значительно повышается. Так, при добавлении интерферона гамма активность NK-лимфоцитов повышается уже через несколько часов. После инкубации с интерлейкином-2 в течение нескольких суток NK-лимфоциты становятся активными в отношении любых трансформированных клеток-мишеней, в том числе опухолевых клеток. В настоящее время исследуется возможность применения активированных цитокинами NK-лимфоцитов при некоторых злокачественных новообразованиях.

IV. Исследование функций фагоцитов

А. Моноциты и макрофаги. С помощью лабораторных методов можно оценить следующие функции моноцитов и макрофагов: представление антигена T-лимфоцитам, антителозависимую клеточную цитотоксичность, противоопухолевую цитотоксичность, хемотаксис, фагоцитоз и бактерицидную активность. Кроме того, можно исследовать продукцию цитокинов активированными макрофагами. Исследование функции моноцитов и макрофагов проводят при недостаточности клеточного иммунитета, атипичных и оппортунистических инфекциях. Это исследование проводится лишь в некоторых специализированных лабораториях.

Б. Нейтрофилы. Исследуют такие функции нейтрофилов, как хемотаксис, фагоцитоз, бактерицидную активность, продукцию свободных радикалов кислорода и адгезию.

1. Хемотаксис нейтрофилов исследуют с помощью камеры Бойдена. Эта камера состоит из двух отделений, между которыми находится фильтр. В одно отделение камеры помещают суспензию нейтрофилов, в другое — хемотаксический фактор, например C5a. После инкубации нейтрофилов в камере Бойдена определяют, какое их количество мигрировало на противоположную сторону фильтра. Другой способ исследования хемотаксиса нейтрофилов основан на применении полужидкого агара. Для исследования хемотаксиса нейтрофилов in vivo используется метод кожного окна (см. гл. 18, п. IV.В.4.а). Нарушение хемотаксиса нейтрофилов характерно для синдрома Чедиака—Хигаси и иногда наблюдается при синдроме гиперпродукции IgE. У больных со слабо выраженной воспалительной реакцией также выявляется снижение хемотаксиса нейтрофилов in vitro.

2. Продукция свободных радикалов кислорода. Активация нейтрофилов сопровождается повышением активности гексозо-монофосфатного шунта, потреблением кислорода и образованием перекиси водорода и свободных радикалов кислорода. Продукцию этих радикалов можно оценить с помощью теста восстановления нитросинего тетразолия и хемилюминесценции (см. гл. 18, пп. IV.В.1). Отсутствие восстановления нитросинего тетразолия — характерный признак хронической гранулематозной болезни. Результаты, полученные с помощью теста восстановления нитросинего тетразолия и хемилюминесценции, обычно совпадают.

3. Оценка бактерицидной активности нейтрофилов. Суть метода заключается в следующем: 1) к нейтрофилам добавляют опсонины и суспензию бактерий; 2) после инкубации определяют число погибших бактерий (см. гл. 18, п. IV.В.3). Для оценки бактерицидной активности нейтрофилов используются разные виды бактерий. Для хронической гранулематозной болезни характерно значительное снижение бактерицидной активности нейтрофилов в отношении Staphylococcus aureus.

4. Исследование молекул адгезии. Обычно определяют экспрессию поверхностных антигенов CD11a/CD18, CD11b/CD18 и CD11c/CD18 с помощью проточной цитофлюориметрии и моноклональных антител к CD11a, CD11b, CD11c и CD18. При иммунодефицитах, обусловленных нарушением адгезии лейкоцитов, наблюдается снижение экспрессии этих антигенов как на покоящихся, так и на активированных нейтрофилах. К лабораторным признакам этих иммунодефицитов относятся нейтрофильный лейкоцитоз, снижение хемотаксической и фагоцитарной активности нейтрофилов и снижение скорости миграции нейтрофилов в очаг воспаления. Иммунодефициты, обусловленные нарушением адгезии лейкоцитов, проявляются рецидивирующими инфекциями, медленным заживлением ран и отсутствием гноя в очагах инфекции.

V. Комплемент — это группа сывороточных белков, состоящая из протеаз и их активаторов. Существуют два механизма активации комплемента — классический и альтернативный (см. гл. 1, п. IV.Г). Комплемент играет важную роль в защите от микробов, активирует катаболизм циркулирующих иммунных комплексов и участвует в регуляции функций иммунной системы.

А. Определение гемолитической активности комплемента. Для исследования компонентов классического пути активации комплемента определяют его гемолитическую активность. Суть метода заключается в следующем: 1) разные разведения сыворотки больного и нормальной сыворотки добавляют к эритроцитам барана, покрытым антителами; 2) степень гемолиза оценивают фотометрически по выходу гемоглобина в раствор. За единицу гемолитической активности комплемента принимают величину, обратную тому разведению сыворотки, при котором разрушаются 50% эритроцитов. Существуют модификации метода, основанные на применении небольших объемов исследуемой сыворотки. Определение гемолитической активности комплемента по 100% гемолизу основано на гемолизе в геле. Суть этого метода заключается в следующем: 1) в геле, содержащем покрытые антителами эритроциты барана, делают лунки; 2) в лунки вносят разные разведения исследуемой и нормальной сывороток; 3) гемолитическую активность комплемента оценивают по диаметру зон гемолиза. Активность комплемента зависит от целого ряда факторов, поэтому нарушение правил забора и хранения сыворотки обычно приводит к ошибочным результатам исследования. Определение гемолитической активности комплемента позволяет обнаружить недостаточность компонентов комплемента, прежде всего участвующих в образовании мембраноатакующего комплекса. Кроме того, оценка этого показателя может использоваться для выявления активации комплемента, например при СКВ и гломерулонефрите, хотя чувствительность метода для этого недостаточно высока. Оптимальный метод выявления активации комплемента заключается в определении продуктов расщепления его компонентов. В настоящее время этот метод находится на стадии разработки. Альтернативный путь активации комплемента исследуют редко.