Материалы и оборудование:

Чашки Петри, колбы с дистиллированной водой, штативы с пробирками, заполненными питательной средой, препарировальные иглы, пинцеты, скальпели, вата, марля, бумага: фильтровальная и целлофановая.
Порядок выполнения работы

1. Металлические инструменты поместить в металлическую биксу и поставить в сушильный шкаф для стерилизации сухим жаром при t 170-200oС в течение 2 часов.

2. Чашки Петри, штативы с пробирками, заполненными питательной средой, вату, марлю, фильтровальную бумагу, колбы с дистиллированной водой (закрытые фольгой) завернуть в плотную крафт-бумагу и поместить в автоклав.

3. Автоклав привести в рабочее состояние: закрыть плотно крышку, воду залить до метки. Включить автоклав, давление пара довести до метки 1,2 атм. (в паровой камере), заполнить паром стерилизационную камеру, вытеснить конденсат в течение 10 минут, при этом давление пара в стерилизационной камере должно быть на уровне 0,1-0,2 атм. Довести давление в стерилизаци- онной камере до 1 атм., включить автоматический режим.

4. Автоклавировать 20 минут при давлении в стерилизационной камере 1- 1,2 атм.

5. Отключить автоклав, вытеснить пар из обеих камер довести давление до 0 атм.

6. Проавтоклавированные материалы перенести в комнату для пересадки тканей и поместить в шкафы или на стеллажи.

Задание 1. Простерилизовать инструменты, посуду и питательные среды, необходимые для проведения работ по выращиванию стерильных проростков.

1. Посуду тщательно отмыть в растворах детергентов, промыть 8-10 раз проточной водой. При необходимости поместить на несколько часов в хромпик (смесь серной кислоты с бихроматом калия), промыть теплой водой, затем дважды дистиллированной водой. 2. Чистую посуду поместить в сушильный шкаф на 1 час при температуре 100-130 ºС. 3. Сухую посуду для хранения закрыть ватными пробками, фольгой, либо завернуть в бумагу. 4. Металлические инструменты, а также чашки Петри, завернутые в плотную бумагу, поместить в сушильный шкаф для стерилизации сухим жаром при температуре 160 ºС в течение 2 часов. 5.Штативы с пробирками или колбы, заполненные питательной средой, колбы с дистиллированной водой (закрытые фольгой), вату марлю завернуть в целлофановую бумагу и поместить в автоклав, автоклавировать 20 минут при давлении в стерилизационной камере 0,5 атм. 6. Проавтоклавированные материалы перенести в комнату для пересадки тканей и поместить в шкафы или на стеллажи.

---

Контрольные вопросы

1. Что такое стерильность?

2. Какими способами стерилизуют посуду, инструменты?

3. Какими способами стерилизуют растительные объекты?

Как простерилизовать питательные среды, дистиллированную воду?

Как происходит стерилизация помещения лаборатории

Работа 4. Стерилизация растительного материала.Техника работы в ламинарном боксе.

Цель работы: освоить методику стерилизации растительного материала, получить стерильные семена пшеницы;освоить технику работы в ламинарном боксе.

Теоретическое обоснование.

Стерилизация растительного материала.

Процесс получения стерильного растительного материала (свободного от эпифитных и ризосферных микроорганизмов) состоит из нескольких этапов.

Первый этап – предварительная стерилизация. Сначала ткани растений предварительно очищают. Корнеплоды, клубни, толстые стебли растений тщательно моют щёткой с мылом в тёплой проточной воде, снимают кожуру (у корней и корнеплодов), кроющие чешуи (у листьев), промывают дистиллированной водой и опускают на несколько секунд (семена на 1-2 мин) в 70%-ный этиловый спирт. Затем растительные объекты многократно прополаскивают в стерильной воде.

Второй этап – стерилизация. Предварительно простерилизованные ткани или органы погружают в стерилизующий раствор. Все процедуры, связанные с использованием стерилизующих веществ, проводят в асептических условиях (ламинар-боксе).

Для стерилизации семян, верхушечных меристем, кусочков ткани, выделенных из различных частей растения, применяют следующие растворы: водный раствор сулемы, 13-28%-ные растворы перекси водорода, 10%-ный хлорамин, 8%-ный гипохлорит натрия или кальция. Для стерилизации можно также использовать хлорсодержащие растворы отбеливателей, например, средство Белизна» (разведение 1:2, 1:3) или дезинфицирующее средство «Domestos».

Стерилизующий агент и продолжительность его воздействия подбирают в зависимости от объекта. При этом важно не только обеспечить достаточную степень чистоты растительного материала, но и сохранить его жизнеспособность.

Продолжительность стерилизации растительного материала приведена в таблице 3

---

Таблица 3 – Продолжительность стерилизации, мин, исходного растительного материала (по Р. Г. Бутенко)

Объект	Диацид 0,1%-ный	Сулема 0,1%-ная	Гипохлорит натрия 5-9%-ный	Пероксид водорода 12%-ный
Семена сухие	15-20	10-15	15-20	12-15
Семена набухшие	6-10	6-8	10-15	6-8
Ткани мясистого корня клубня	20-30	15-25	15-20	-
Ткани одревесневшего стебля	20-40	20-25	20-25	-
Листья	1-3	1-3	3-6	3-5
Апексы	1-10	1-7	3-15	2-7

Примечание: диацид и сулема – ртутьсодержащие препараты и в настоящее время почти не используются.
Третий этап – отмывание объекта от стерилизующего раствора (постстерилизация). При этом растительный материал промывают 3-4 порциями стерильной дистиллированной воды, выдерживая его в каждой порции в течение 10-15 мин.

После стерилизации растительные объекты следует тщательно отмыть от стерилизующих веществ, многократно последовательно ополаскивая дистиллированной водой.
Все операции, связанные с культивированием растительных эксплантов, стерильных проростков проводятся в ламинарном боксес соблюдением правил стерильности.

Перед работой все поверхности ламинарапротирают 70% спиртом. На стол ламинарараскладывают необходимые инструменты, посуду, материалы. Перед началом работы внутреннее пространство ламинара облучают УФ-лучами в течение 20 минут, после чего включают биофильтры на 10-15 минут. Для работы в ламинар-боксе надевают стерильный халат и шапочку, руки обрабатывают 70-96% спиртом. Пинцеты, скальпели и препаровальные иглы помещают в химический стакан со спиртом. Перед каждой манипуляцией инструменты обжигают на пламени спиртовки.

---

Материалы и оборудование: ламинарный бокс, термостат; стакан со спиртом, спиртовка, спички; пинцет не стерильный, стерильные инструменты (скальпель, пинцет); стерильные чашки Петри, стаканчики на 100 мл, дистиллированная вода, гипохлорит натрия, марля, нитки, фильтровальная бумага, пищевая пленка; семена озимой пшеницы, моркови, перца и др.;пробирки с питательной средой МурасигеСкуга без гормонов.

Порядок выполнения работы:

При работе со стерильной посудой и материалом необходимо помнить о том, что нельзя проносить руки над открытой стерильной поверхностью. Колбы и другие сосуды, закрытые крышками из фольги и бумаги, необходимо открывать следующим образом: бумагу снимают до внесения колбы в ламинар-бокс. Фольгу обжигают, пронося горло сосуда над пламенем спиртовки, затем осторожно разворачивают края фольги с помощью стерильного пинцета и снимают ее. Закончив работу, закрывают сосуд: обжигают горло сосуда, стерильным пинцетом берут крышку из фольги, обжигают с двух сторон и закрываютгорло колбы. Когда фольга остынет, прижимают ее плотно к горлу сосуда. После этого сосуд можно вынести из ламинар-бокса, сверху покрыть фольгу бумагой.

Все операции должны производиться с соблюдением правил стерильности: все стерильные работы проводят вблизи пламени горелки, переливание зараженных жидкостей производят над лотком с дезинфицирующим раствором и т. п.
Провести предварительную стерилизацию семян (в нестерильных условиях):

1. 
   Отобрать десять здоровых зерновок пшеницы (семена моркови, перца и др.).
   
2. 
   Поместить их в марлевый мешочек и промыть их в мыльном растворе, а затем водопроводной и дистиллированной водой.
   

Работа в ламинарном боксе:

3. 
   Перед работой поместить в ламинар-бокс инструменты, посуду и материалы, необходимые для работы. Пинцет, скальпель поместить в стакан со спиртом.
   
4. 
   Включить УФ-лампу. Через 20 минут выключить УФ и включить биофильтры.
   
5. 
   Протереть руки и рабочую поверхность ламинар-бокса 70 %-ным раствором спирта.
   
6. 
   Зажечь спиртовку.
   

Провести стерилизацию семян в ламинарном боксе:

7. 
   Отобрать десять здоровых зерновок пшеницы (семена моркови перца и др.), промыть их в мыльном растворе, а затем водопроводной и дистиллированной водой.
   
8. 
   Поместить в марлевые мешочки и погрузить на 1-2 минуты в 70-96% спирт, после чего простерилизовать в 15% растворе перекиси водорода в течение 10 минут, или в 6% растворе 19 хлорамина – в течение пяти минут.
   
9. 
   Затем промыть стерильной дистиллированной водой 3-5 раз, меняя ее через каждые 5-7 минут.
   
10. 
    С помощью стерильного пинцета разложить семена на влажную фильтровальную бумагу в стерильной чашке Петри.
    

---

Семена пшеницы промыть мыльной водой; воду слить, а семена поместить в светло-розовый раствор KМnO4. Через 20 мин слить раствор и залить семена 70%-ным этанолом на 1 мин.

Все последующие процедуры проводят в ламинар-боксе. Предварительно простерилизованные семена поместить в стаканчики, содержащие по 30 мл различных стерилизующих растворов (3 % -ного гипохлорита натрия, 10 %-ного хлорамина, дезинфицирующего средства «Domestos» разведение 1:2). Продолжительность стерилизации – 15 мин. По истечении указанного времени слить стерилизующие растворы, налить в стаканчики немного стерильной воды. Затем слить воду и налить новую ее порцию. Промывание водой продолжается в течение 1 ч со сменой через каждые 15 мин. Проращивание семян может осуществляться двумя способами: 1. Семена прорастают на питательной среде, где затем продолжают свой рост. В этом случае работу выполняют следующим образом. Пинцет прокалить в пламени спиртовки, остудить и с его помощью перенести по 4–5 штук стерильных семян в пробирки, содержащие агаризованную среду МС без гормонов. Стерильно закрыть пробирки алюминиевой фольгой. Пробирки с семенами поместить в термостат при температуре 25 ºС. Через 4–6 суток проверить чистоту посева и всхожесть семян. После прорастания семян перенести пробирки в условия фитостата с освещением 1000 лк и комнатной температурой.

2. Семена проращивают на фильтровальной бумаге, смоченной водой, затем их переносят на питательную среду. Для этого необходимо смочить стерильной водой фильтровальную бумагу в стерильной чашке Петри, затем прокаленной и остуженной лопаткой перенести семена в чашку, разместить их более-менее равномерно, закрыть чашку и герметизировать ее клейкой лентой для уменьшения испарения. Чашку с семенами поместить в термостат при температуре 25 ºС. Через 4–5 сут после прорастания перенести семена стерильным пинцетом в пробирки с агаризованной питательной средой МС без гормонов и поместить в фитостат. Второй способ дает возможность выращивать в пробирке 1-2 растения, обеспечивая их нормальное питание, однако дополнительные операции по проращиванию семян и пересадке растений увеличивают вероятность заражения.

11. 
    Для получения проростков на питательной среде поместить по одному семени в пробирку со стерильной средой МС.
    
12. 
    Закрыть пробирки фольгой, предварительно обжигая их на пламени спиртовки. Горлышко замотать пищевой пленкой.
    
13. 
    Пробирки и чашки Петри с семенами поставить в термостат при температуре 25-26 °С. Для получения неэтиолированных проростков семена выращивают на свету при той же температуре.
    
14. 
    После окончания работы привести рабочее место в порядок: протереть поверхность бокса спиртовым раствором. Внутри бокса, кроме стаканчика с инструментами и горелки, ничего не оставлять!
    

---

Смотрите также файлы

• Практических заданий по дисциплине правовые основы оперативнорозыскной деятельности.docx

• 15. Какие показатели характеризуют стоимость и доходность акций предприятия.docx

• Урок русского языка в 6 классе по теме Девятнадцатое февраля Классная работа Весна.pptx

• 10. Оценка риска и эффективности инвестиционных проектов в логистике.docx

• Челябинский филиал федеральное государственное автономное образовательное учреждение.pdf