---

Контрольные вопросы:

1. 
   Что такое ламинарный бокс?
   
2. 
   Каким образом осуществляется подготовка к работе ламинар-бокса?
   
3. 
   Назовите основные правила работы в условиях ламинар-бокса.
   
4. 
   Охарактеризуйте основные этапы проведения стерилизации растительных объектов.
   

Работа Приготовление маточных растворов макро- и микросолей

Цель работы. Приготовление маточных растворов минеральных солей для питательнойсредыМурасиге-Скуга

Растворы макросолей, микросолей и витаминов удобно готовить концентрированными.

Маточные растворы хранят в холодильнике, витамины при отрицательной температуре. В 10-20 раз более концентрированными, чем нужно, готовят растворы макросолей, в 100-1000 раз более концентрированными-растворы микросолей, в 1000 раз-растворы витаминов.
Маточные растворы минеральных солей готовят на дистиллированной воде. Для питательной среды МурасигеСкуга обычно готовят маточные растворы следующего состава:

1) раствор макроэлементов;

2) раствор CaCl₂;

3) раствор хелата железа (раствор FeSO₄и ЭДТА);

4) раствор микроэлементов.

Количество солей, необходимое для приготовления маточных растворов, а также количество маточного раствора, которое надо взять для приготовления питательной среды, приведены в табл. 1

Полученные растворы сливают в банки с крышкой, снабжают этикеткой и хранят в холодильнике. Хелат железа хранят в темной банке.
Таблица 1. Расчеты для приготовления маточных растворов по МС

Компоненты питательной среды	Навеска	Объем маточного раствора, мл	Количество маточного для приготовления 1 л питательной среды
Макросоли, г (на 1 л маточного раствора)
NH4NO3 KNO3 KH2PO4 MgSO4·7H2O	33 38 3,4 7,4	1000	50
Источник кальция, г (на 100 мл маточного раствора)
CaСI2(безводный) или CaСI2·2H2O	8,8 13,8	100	5
Микросоли, мг (на 100 мл маточного раствора)
H3BO3 MnSO4·4H2O ZnSO4·7H2O KI Na2MoO4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O	620 2230 860 83 25 2,5 2,5	1000	1
Хелат железа, мг (на 100 мл маточного раствора)
FeSO4·7H2O Na2ЭДТА·2H2O	557 745	100	5

---

Ход работы.
Контрольные вопросы:

1. 
   Что такое маточные растворы и как их готовят?
   

Работа Приготовление маточных растворов витаминов и фитогормонов

Цель работы. Приготовление маточных растворов витаминов и фитогормонов для питательнойсредыМурасиге-Скуга

Растворы витаминов и фитогормонов удобно готовить концентрированными.
Витамины и фитогормоны хранят в
Для приготовления концентрированных растворов витаминов берут десятикратную по отношению к добавляемой дозе навеску витамина и растворяют в 10 мл воды. В 1 мл этого раствора содержится порция витамина, необходимая для приготовления 1 л раствора по прописи Мурасиге-Скуга.

Концентрированные растворы витаминов (каждого в отдельности) хранят во флакончиках вхолодильникепри отрицательной температуре.

Фитогормоны – это биологические регуляторы роста и раз- вития растений, осуществляющие взаимодействие клеток, тканей и органов, стимулирующие и ингибирующие морфогенетические и физиологические процессы в растительных организмах. Фитогормоны влияют на деление и рост клеток растяжением, состояние покоя, созревание, старение, формиро- вание пола, устойчивость к стрессу, тропизмы, транспирацию; обеспечивают функциональную целостность растительного организма, закономерную по- следовательность фаз индивидуального развития.
По функциональному действию различают 5 основных групп фитогор- монов: ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизины и этилен.

Ауксины в культуре тканей вызывают рост клеток растяжением, в больших концентра- циях – деление клеток, в сочетании с цитокининами – органогенез. В биотех- нологии применяют как природные ауксины (ИУК), так и синтетические [ИМК (индолил-З-масляная кислота), ИПК (индолил-З-пропионовая кисло- та), 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота), НУК(нафтилуксуснаяки- слота)].

В качестве источников ауксинов в питательных средах обычно используют 2,4- дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д)- 1-10 мг/л, а также индолилуксусную кислоту (ИУК) - 1­30 мг/л, и -нафтилуксусную кислоту (НУК) - 0,1-2 мг/л. ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д. Для индукции образования каллуса обычно применяют высокие концентрации ауксинов, а при последующих пересадках ткань может расти, если содержание ауксинов в среде уменьшено в несколько раз.

---

Цитокинины в сочетании с ауксинами индуцируют митозы, пролифера- цию клеток, почек и побегов. К природным цитокининам относятся: зеатин, кинетин (6-фурфуриламинопурин), NN-дифенилмочевина (кокосовое моло- ко); к синтетическим – 6-БАП (6-бензиламинопурин).

В качестве источника цитокининов в искусственных питательных смесях используют кинетин, 6-бензиламинопурин (6-БАП), зеатин (0,001-10 мг/л). Зеатин и БАП более активны в поддержании роста изолированных тканей и индукции органогенеза, чем кинетин. В состав некоторых питательных смесей входит аденин.

Гиббереллины стимулируют рост клеток растяжением, а также синтез ауксинов и цитокининов. В культуре ткани используется гибберелловая кислота.

Абсцизины (АБК – абсцизовая кислота) и этилен ингибируют ростовые процессы, деление клеток, в сочетании с цитокининами и хлорхолинхлоридом индуцируют органогенез (образование микроклубней).
Ход работы.

Растворы фитогормонов готовят следующим образом.

Ауксины (2,4-Д, НУК, ИУК, ИМК): 100 мг вещества растворяют в 0,5-2 мл спирта, подогревают, добавляют дистиллированную воду до 100 мл (концентрация 1 мг/мл).

Цитокинины (6-БАП,кинетин, зеатин): растворяют в небольшом объеме 0,5 н. HCl, подогревают, добавляют соответствующий объем дистиллированной воды.

Абсцизовая кислота (АБК): навеску растворяют в 70%-ном этаноле, доводя до нужногообъема.

Гиббереллиновая кислота (ГК): навеску растворяют в воде.
Контрольные вопросы:

1. Что такое фитогормоны и для чего они необходимы при культивировании изолированных клеток и тканей?

2. Какие вещества используют в качестве ауксинов в питательных средах?

3. Какие вещества используют в качестве цитокининов в питательных средах?

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Цель работы. Приготовление питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей на примере среды Мурасиге-Скуга

Теоретическое обоснование.

Для культивирования клеток, тканей и органов тех или иных растенийиспользуют питательные среды различного состава. Наиболее широко применяются среда Мурасиге-Скуга (табл.1, 2), среда Уайта (табл.2.3), среда Гамборга, или В-5 (табл.2.4).
Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы, витамины, углеводы, фитогормоны. Некоторые питательные среды содержат гидролизат казеина, определенные аминокислоты. Кроме того, в состав питательных сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, повышающие доступность железа для клеток в широких пределах рН.

---

Углеводы выступают необходимым компонентом питательных сред при культивировании изолированных клеток и тканей, так как они не способны к автотрофному питанию. Обычно в качестве источника углеводов используют сахарозу или глюкозу в концентрациях 20-40 г/л. Опухолевые ткани, в которых много активных гидролитических ферментов, могут расти на средах с растворенным крахмалом.
Для приготовления твердых питательных сред используют агар-агар-полисахарид, получаемый из морских водорослей. Наименьшее количество нежелательных примесей содержат бактериальный агар«Difco» и бактериальный агар отечественного производства, их можно применять без предварительной промывки. Обычно для получения твердой питательной смеси к среде добавляют 5-8% агара.
Материалы и оборудование: Химреактивы (табл.1). Колбы или стаканы химические на 1л, банки с притертыми пробками для хранения маточных растворов на 1л и 100мл, баночки на 20-50мл, мерные пипетки на 10 и 1мл, весы технические, весы торзионные, электроплитка.
Содержание и порядок выполнения практической работы.

Приготовить питательную среду Мурасиге и Скуга (табл.1, 2) для культивирования растительных органов и тканей.

Теперь, используя маточные растворы, надо приготовить питательные среды для культивирования органов и тканей растений. В химический стакан или колбу емкостью 1л помещают навеску сахарозы 30 г, доливают до половины дистиллированную воду, нагревают, после растворения сахарозы добавляют необходимые количества маточных растворов макросолей, микросолей (см. табл. 2.2.), витаминов и доводят объем до 1л дистиллированной водой.

При введении фитогормонов в среду перед автоклавированием следует обязательно довести рН среды до 5,5-5,6.

Однако следует учитывать, что после автоклавирования изменяется первоначальный состав термолабильных компонентов среды. Так, тиамин распадается на пиримидин и тиазол, а кинетин и ИУК теряют часть своей активности. В связи с этим витамины и особенно термолабильные фитогормоны стерилизуют фильтрованием, пропуская через фильтр Зейца или «Миллипор» с диаметром пор 0,4 мкм (НУК, ИУК, зеатин, БАП). В этом случае для регуляции рН среды используют стерильные растворы щелочи.

---

Смотрите также файлы

• Практических заданий по дисциплине правовые основы оперативнорозыскной деятельности.docx

• 15. Какие показатели характеризуют стоимость и доходность акций предприятия.docx

• Урок русского языка в 6 классе по теме Девятнадцатое февраля Классная работа Весна.pptx

• 10. Оценка риска и эффективности инвестиционных проектов в логистике.docx

• Челябинский филиал федеральное государственное автономное образовательное учреждение.pdf