Файл: Методические указания для лабораторных работ по дисциплине Сельскохозяйственные биотехнологии.docx
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 25.10.2023
Просмотров: 150
Скачиваний: 6
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Агар-агар предварительно замачивают в воде для набухания. Затем его нагревают на электроплитке при помешивании до полного растворения. После этого раствор агара надо слить с раствором солей, витаминов и сахарозы и довести объем среды до 1л. Колбы со средой закрывают ватной пробкой, бумагой или фольгой и стерилизуют в автоклаве.
Питательные среды разливают в пробирки (1/3 объема), которые закрывают фольгой, стерилизуют в автоклаве.
Требования к отчету по практической работе
Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.
Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.
Контрольные вопросы.
-
Каков состав питательных сред для изолированных клеток и тканей?
Приложение.
Таблица 1. Среда Мурасиге и Скуга, рН 5,6-5,8
| Компоненты | Содержание, мг/л | Компоненты | Содержание, мг/л |
| NH4NO3 | 1650 | Fe2SO4 7H2O | 27,8 |
| KNO3 | 1900 | Na2-ЭДТА 2H2O | 37,3 |
| CaCl2 . 2H2O | 440 | Тиамин - HCl | 0,1 |
| MgSO4 . 4H2O | 370 | Пиридоксин - HCl | 0,5 |
| KH2PO4 | 170 | Никотиновая кислота | 0,5 |
| MnSO4 . 4H2O | 22,3 | Мезо-инозит | 100 |
| CoCl2 . 6H2O | 0,025 | Глицерин | 2,0 |
| ZnSO4 . 7H2O | 8,6 | ИУК | 2,0 |
| CuSO4 . 5H2O | 0,025 | Кинетин | 0,2 |
| Na2MoO4 . 2H2O | 0,25 | Сахароза | 30.000 |
| Kl | 0,83 | | |
Таблица 1. Среда Уайта, рН 5,6-5,8
| Компоненты | Содержание, мг/л | Компоненты | Содержание, мг/л |
| Ca(NO3)2 | 200 | CuSO4'5H3O | 0,02 |
| MgSO4 | 360 | ZnSO4 | 1,5 |
| Na2SO4 | 200 | Na3MoO4'2H2O | 0,0025 |
| KNO3 | 80 | Kl | 0,75 |
| KCl | 65 | Пиридоксин-HCl | 0,1 |
| NaH2PO4 | 16,5 | Тиамин-HCl | 0,1 |
| H3BO3 | 1,5 | Никотиновая кислота | 0,5 |
| MnSO4 | 4,5 | Глицин | 3,0 |
| Fe(SO4)3 | 2,5 | Сахароза | 20.000 |
Таблица 2. Среда Гамборга (В-5), рН 5,8
| Компоненты | Содержание, мг/л | Компоненты | Содержание, мг/л |
| Na^PO^O | 150 | | 37,3 |
| KNO3 | 2500 | Na2MoO4.2H20 | 0,25 |
| (NH4)2SO4 | 134 | Kl | 0,75 |
| MgSO4'7H2O | 250 | FeSO4.7H2O | 28,0 |
| CaCh^O | 150 | Тиамин- HCl 10,0 | |
| H3BO3 | 3,0 | Пиридоксин- HCl | 1,0 |
| MnSO^^O | 10,60 | Никотиновая кислота | 1,0 |
| CoCh'6H2O | 0,025 | Мезо - инозит | 100 |
| CuSO^^O | 0,025 | 2,4-Д | 2,0 |
| ZnSO4'7H2O | 2,0 | Сахароза | 20.000 |
Работа 5. Выращивание асептических проростков
Цель работы: подобрать концентрацию стерилизующего раствора и время стерилизации семян, которые обеспечат наивысшую эффективность этого процесса. Простерилизовать семена и вырастить из них асептические проростки.
Теоретическое обоснование.
Основное условие выращивания invitro растительных клеток, тканей и органов – это стерильность. Но поверхностные ткани органов растений инфицированы эпифитными бактериями, грибами и их спорами. В связи с этим первым шагом для получения изолированных клеток, тканей и органов растений является стерилизация растительного материала. Как правило, режим стерилизации устанавливают экспериментально для каждого объекта. Но существуют общие правила, которых следует придерживаться.
Для стерилизации используют широкий спектр разных стерилизующих веществ: хлорамин, «белизна»; ртутные препараты – сулема, диацид; окислители – перекись водорода, перманганат калия. Правильный выбор стерилизующего вещества заключается в том, чтоб нейтрализовать эпифитную микрофлору и не повредить ткани растения. Кроме того, вещество не должно глубоко проникать в ткань и должно легко вымываться. Растительные ткани после стерилизации необходимо трижды промыть в стерильной дистиллированной воде по 10–20 минут каждый раз.
Материалы и оборудование: ламинарный бокс, 70 % раствор этилового спирта, стерильная вода, «белизна», стаканчики для стерилизующих растворов, семена пшеницы и др. культур, пробирки со стерильной безгормональной средой МС, инструменты
Порядок выполнения работы:
1. Приготовить раствор белизны разной концентрации – 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 1 : 4 (растворы используются однократно и готовят непосрественно перед употреблением).
2. В марлевые мешочки поместить по 10-20 семян исследуемых растений.
3. Промыть семена мыльным раствором.
4. Мешочки с семенами погрузить в стаканчики с 70 %-ным этанолом на 1-2 минуты.
5. Стерильным пинцетом перенести мешочки в стаканчики соответствующей концентрации стерилизующего раствора и выдержать соответствующее время (см. таблицу).
6. Простерилизованные семена промыть стерильной дистиллированнной водой – 3 раза по 10 минут.
7. В ламинар-0боксе стерильным пинцетом перенести семена на безгормональную питательную среду в пробирки.
8. Пробирки соответственно подписать и поместить в термостат (люминестат) при температуре 26 оС на неделю.
9. Через 5–7 суток проанализировать чистоту посева и всхожесть семян.
10. Результаты представить в виде таблицы.
11. Определить наиболее эффективные условия стерилизации семян.
12. Сделать соответсвующие выводы.
Всхожесть семян в процентах рассчитывают как отношение количества проросших семян к общему числу посаженных, умноженное на 100 %.
Эффективность стерилизации рассчитывают как отношение количества проросших, не поврежденных инфекцией семян к общему количеству семян, посаженных на безгормональную среду. Выражают в процентах (%).
Контрольные вопросы:
1. Какие методы стерилизации используют при работе в биотехнологической лаборатории?
2. Что такое стерилизация и какие существуют виды стерилизации?
3. Как проводят стерилизацию помещений?
4. Как стерилизуют материалы и инструменты?
5. Какими способами можно стерилизовать посуду?
6. Чем отличается стерилизация сухим и влажным паром?
7. Для чего проводят стерилизацию растительного материала?
8. Какие вещества используют для стерилизаии семян?
9. Для чего необходимо подбирать режим стерилизации растительного материала?
10. Для чего используют аспетические проростки в методах культуры растительных клеток и тканей?
ВЫРАЩИВАНИЕ СТЕРИЛЬНЫХ ПРОРОСТКОВ
Цель работы. Выращивание стерильных проростков гороха, сои с целью получения асептических растений и получения эксплантовinvitro
Теоретическое обоснование. Стерильные проростки выращивают с целью получения асептических растений и получения эксплантовinvitro. В зависимости от задачи опыта семена высевают на воду или агаризованную питательную среду.
Существуют три возможных пути использования стерильных проростков:
1) для получения эксплантов из дифференцированных тканей, которые при переносе на питательную среду, содержащую фитогормоны, дифференцируются и в результате интенсивной