Манипуляции Номера пробирок опытные контрольные 1234 5 1к 2к Зк Приготовление разведе- 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:10 — — ний типоспецифической сыворотки Внесение сыворотки, мл 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 — — Внесение суспензии ви- 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 — 0,2 — руса (4 гемагглютини-рующие дозы в 0,2 мл) Внесение изотоническо- — — — — — — 0,2 0,4 го раствора хлорида на­трия, мл Экспозиция 60 мин при комнатной температуре Внесение 1 % суспензии 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 эритроцитов курицы, мл Экспозиция 30—60 мин при комнатной температуре Учет результатов

Типоспецифи- Разведение сыворотки Контроль ческая проти 1 1 1 1 1 вогриппозная 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 сыво- виру- эрит- сыворотка ротки са роци- тов HON1 — + -Н-+ +++ +++ — +++ — H1N1 — ++ +++ +++ +++ — +++ — H3N2 ______ +++ _

Тема 10.2. МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ (СЕРОДИАГНОСТИКА)

Количество специфических антител в сыворотке крови можно определить методами непосредственного выявления связывания со специфическим антигеном. Два наиболее совре­менных метода серологических исследований: радиоиммунный и иммуноферментный. В любом случае нужен известный очи­щенный антиген, к которому прикрепляется метка: радионук-лидная или ферментная. Соответственно связывание меченого антигена с антителами учитывается радиометрическим или спек-трофотометрическим методом.

Кроме методов непосредственного выявления связывания антител с антигеном, используют серологические исследова­ния, основанные на изменении свойств антигена: реакции агглютинации, преципитации, иммунного лизиса, связывания комплемента, нейтрализации.

План

Программа

Методы непосредственного выявления связывания ан­тигена с антителами: радиоиммунный метод, иммуно­ферментный метод, иммунофлюоресцентный метод.

Методы связывания антигена с антителами, проявля­ющегося изменением свойств антигена: реакция агг­лютинации, реакция преципитации, реакции иммун­ного лизиса, реакция связывания комплемента, реак­ции нейтрализации.

Демонстрация

1. Диагностические препараты для выявления антител (диагностикумы).

Задание студентам

Протоколировать и оценить результаты развернутой реакции агглютинации, поставленной с целью опре­деления титра специфических антител в исследуемой сыворотке.

Протоколировать и оценить результаты РИГА, постав­ленной с целью серодиагностики.

Протоколировать и оценить результаты реакции преци­питации в геле, поставленной с целью серодиагностики.

Протоколировать и оценить результаты титрования ком­племента с целью расчета рабочей дозы комплемента.

---

Протоколировать и оценить результаты реакции свя­зывания комплемента (РСК), поставленной с целью серодиагностики.

Протоколировать и оценить результаты реакции Кумбса, поставленной с целью определения титра непол­ных антител в исследуемой сыворотке.

Протоколировать и оценить результаты иммуноферментного анализа с целью выявления специфических антител в исследуемых сыворотках.

Протоколировать и оценить результаты реакции флоккуляции, поставленной с целью титрования антиток­сической сыворотки.

Протоколировать и оценить результаты антистрептолизиновой реакции, поставленной с целью серодиагностики ревматизма.

10. Протоколировать и оценить результаты РТГА, постав­ленной с целью серодиагностики вирусной инфекции. Сделать заключение по результатам каждой серологи­ческой реакции.

Методические указания

Для приготовления сыворотки взятую из вены кровь в коли­честве 3—4 мл помещают в термостат при 37 °С на 10—15 мин. После свертывания крови сгусток отслаивают от стенок пробир­ки стеклянной палочкой и выдерживают при 4 °С в течение часа для лучшей ретракции сгустка и более полного отделения сы­воротки. Затем сыворотку осторожно отсасывают пипеткой.

1. Радиоиммунный метод. Количество специфических анти­тел в исследуемом образце можно определить, используя вари­ант конкурентного связывания: по их способности ингибиро-вать связывание радиоактивно меченных антител со специфи­ческим антигеном, фиксированным на твердой фазе. Но чаще используют метод выявления связавшихся с антигеном на твер­дой фазе специфических антител с помощью радиоактивно меченных антииммуноглобулиновых антител, специфичных к константной области молекулы иммуноглобулина. Проще все­го получить антииммуноглобулиновую сыворотку путем имму­низации животных одного вида иммуноглобулинами живот­ного другого вида. Такая антииммуноглобулиновая сыворотка будет связывать любые молекулы иммуноглобулинов соответ­ствующего вида (мышей, кроликов или других видов). Такую меченную радионуклидами антииммуноглобулиновую сыво­ротку против иммуноглобулинов человека используют в РИА для выявления связывания немеченых человеческих антител на фиксированном антигене. Эта антииммуноглобулиновая сыво­ротка "распознает" антитела разной специфичности, связыва­ясь с антигенными эпитопами в константной части молекул.

Используя РИА или ИФА, можно определить не только количество антигенспецифических антител, но и принадлеж­ность этих антител к тому или иному изотипу иммуноглобули­нов. Для этого используют антииммуноглобулиновые антитела, специфичные для отдельных изотипов иммуноглобулинов. Получение таких антииммуноглобулиновых антител начинается с иммунизации животного очищенным препаратом одного из изотипов иммуноглобулинов. Из полученной иммунной сыво­ротки путем многократной абсорбции удаляют все антитела, перекрестно реагирующие с иммуноглобулинами других изо­типов. Полученные антиизотипические антитела используют для определения количества антител каждого из изотипов в иммунной сыворотке, реагирующей с антигеном. Особая роль отводится антителам против IgE, которые позволяют опреде­лить количество иммуноглобулинов этого изотипа и специфи­ческих антител, относящихся к этому изотипу, при лаборатор­ной диагностике аллергических реакций анафилактического типа и атонических заболеваний.

---

Иммуноферментный анализ. Одним из наиболее чувстви­тельных методов выявления антител считается ИФА, который не уступает по чувствительности РИА и в то же время отлича­ется от него большей доступностью для обычных диагности­ческих лабораторий. Специфический антиген адсорбируют на поверхности лунок в пластинах из полистирола (поливинилхлорида). Фиксированный на пластине антиген инкубируют с испытуемыми человеческими сыворотками. После отмывания от несвязавшихся белков связанные иммобилизованными ан­тигенами иммуноглобулины выявляют с помощью антивидовой (античеловеческой) антииммуноглобулиновой сыворотки, меченной ферментом пероксидазой. После инкубации с суб­стратом (пероксидом водорода) и индикатором оценивают фер­ментативную активность по интенсивности окраски. Интен­сивность окраски, пропорциональную количеству сорбирован­ных на антигене антител, можно оценить визуально или с помощью спектрофотометра. В данной модификации удобна универсальность меченого реагента, который позволяет выяв­лять антитела к разным антигенам.

Иммуноэлектрофорез. Для выявления антител, специфи­ческих по отношению к отдельным антигенным компонентам в составе сложной смеси, например к отдельным антигенам
микроорганизмов, приходится прибегать к методам выделения белков из смеси. Одним из наиболее популярных методов выделения белков является электрофорез в полиакриламидном
геле (PAGE) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS), который получил сокращенное обозначение: SDS-PAGE. Бел­ковые фракции распределяются в геле в соответствии с их
размерами. После этого разделенные в электрофоретическом поле белки переносят на нитроцеллюлярную пластину, где они обрабатываются специфической антисывороткой. Положение
белков, с которыми связываются специфические антитела, вы­является с помощью антииммуноглобулиновых антител, ме­ченных ферментом или радионуклидом. Этот метод получил
название Western blot и используется в качестве уточняющего при выявлении в сыворотке крови антител против вируса им­мунодефицита человека. Для этого белки вируса разделяют с помощью SDS-PAGE, разделенные белки переносят на плас­тину нитроцеллюлозы и проводят инкубацию с испытуемой сывороткой. Антитела из сыворотки связываются с разными антигенными фракциями, что выявляется с помощью фер-ментно-меченой антииммуноглобулиновой сыворотки против иммуноглобулинов человека.

4. Иммунофлюоресцентный метод. Используется, например, в серодиагностике сифилиса. Мазок из взвеси T.pallidum на стекле обрабатывают исследуемой сывороткой, в которой по­дозревается присутствие специфических антител. Если в сыво­ротке имеются антитела против антигенов спирохеты, они свя­зываются с микробом. Избыток антител удаляют отмыванием.
Мазок дополнительно обрабатывают флюоресцирующей сыво­роткой против человеческих иммуноглобулинов. О выявлении специфических антител в исследуемой сыворотке будет свиде­тельствовать обнаружение светящихся спирохет при люмине­сцентной микроскопии мазка.

---

Аналогичным методом выявляют антинуклеарные антитела (антитела против ДНК) в сыворотке крови при ряде аутоим­мунных заболеваний, используя в качестве антигена ядерные клетки животного происхождения.

5. Реакция развернутой агглютинации. Сначала готовят основное разведение сыворотки, из которого делают серию раз­ведений путем последовательного переноса 1 мл из предыду­щей пробирки в следующую пробирку ряда. Из последней пробирки 1 мл разведенной сыворотки удаляют для сохранения одинакового объема. В контрольную пробирку (контроль анти­
гена) вносят 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. В каждую пробирку с разведениями сыворотки и в контроль­ную пробирку вносят пастеровской пипеткой по 2 капли взвеси
бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37 °С на 2 ч, затем сутки выдерживают при комнатной температуре. Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последователь­нл каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном сшвании. В контрольных пробирках агглютинации не должыть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следу-ми знаками: "++++" — полная агглютинация (хлопья агг-F "1л|бтината в абсолютной прозрачной жидкости), "+++" — непол­на Ля агглютинация Схлопья в слабоопалеспигпто]

* агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости),

jt ⁽*f+" — частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жид­кость слегка мутная), "+" — слабая , сомнительная агглютинация (жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы), "—" — отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная) (рис. 10.2.1).

За титр сыворотки принимают последнее ее разведение, в

Как правило, в центральную лунку заливают стандартный раствор антигена, а в периферические — испытуемые сыворот­ки. В одну из периферических лунок вносят стандартную им­мунную сыворотку соответствующей специфичности, а в дру­гую — нормальную сыворотку для контроля. Антиген с сыво­ротками инкубируют во влажной камере при 37 "С в течение 24 ч, после чего учитывают количество и ширину полос пре­ципитации между центральной лункой с раствором антигена и лунками с исследуемыми сыворотками.

8. Реакция лизиса. Реакция связывания комплемента. Для постановки реакции лизиса и РСК используют комплемент, который содержится в сыворотке крови морских свинок. Ге­молитическая активность комплемента термолабильна и пол­ностью утрачивается при прогревании сыворотки в течение 30 мин при 56 ^СС. При адсорбции комплемента на комплексе антиген—антитело его действие проявляется реакцией лизиса антигена, если антиген корпускулярный, или не сопровожда­ется видимыми изменениями, если это мелкодисперсные или растворимые антигены. Для учета результатов РСК вводят вспо­могательную (индикаторную) гемолитическую систему. Она со­стоит из взвеси эритроцитов барана в изотоническом растворе хлорида натрия и гемолитической сыворотки кролика, полу­ченной путем его иммунизации упомянутыми эритроцитами. Положительная РСК характеризуется задержкой гемолиза вслед­ствие адсорбции комплемента системой антиген—антитело (рис. 10.2.3). Отрицательная РСК характеризуется наличием гемолиза, поскольку свободный комплемент связывается с ин­дикаторной системой антиген—антитело, т.е. эритроциты ба­рана — гемолитическая сыворотка кролика. РСК обладает вы­сокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет использовать ее для серодиагностики многих заболеваний.

---

Для постановки РСК требуется точное определение коли­чественных соотношений всех ингредиентов, участвующих в реакции: исследуемой сыворотки, антигена, комплемента, ге­молитической сыворотки кролика и эритроцитов барана. По­этому постановке основного опыта предшествует титрование гемолитической сыворотки и выбор ее рабочего разведения, титрование других ингредиентов.

Постановка РСК должна сопровождаться контролями для проверки отсутствия антикомплементарных ингредиентов в препаратах антигенов и в исследуемой сыворотке. Антиком­плементарные свойства антигенов или сыворотки могут быть связаны с присутствием в их составе денатурированных или агрегированных иммуноглобулинов, гепарина, оксидантов, мик­робных контаминант. Эти компоненты могут либо связывать комплемент, либо связывать и удалять ионы кальция или магния, необходимые для комплементопосредованного гемо­лиза.

Манипуляции Номера пробирок 123456789 Внесение ком- 0,3 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 — — племента в раз­ведении 1:5 мл Внесение изото- 0,3 0,4 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,2 — нического раст­вора хлорида натрия, мл Удаление из 0,4 0,4 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 — — пробирки из­бытка, мл Получаемые 1:10 1:15 1:20 1:25 1:30 1:35 1:40 - -разведения ком­племента Добавление ге- 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 молитической смеси, мл Инкубация 390 мин при температуре 37 "С Учет результатов

Манипуляции Номера пробирок 1234567 Внесение испытуемой сыво- 0,2 — — 0,2 — — — ротки в разведении 1:5, мл Внесение заведомо "поло- — 0,2 — — — — — жительной" сыворотки, мл Внесение заведомо "отри- — — 0,2 — — — — дательной" сыворотки, мл Внесение антигена, мл 0,2 0,2 0,2 — 0,2 — —

---

Смотрите также файлы

• ГИПЕРТЕНЗИЯ, Эклампсия.doc

• ДИВ.doc

• ВЗРП.doc

• Внутриутробная задержка развития плода.doc

• Антенатальный 20уход_24Nov[1].doc