Тема 6.1. МОДИФИКАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ, МУТАЦИИ, РЕКОМБИНАЦИЯ И ПЕРЕНОС ГЕНОВ МЕЖДУ БАКТЕРИЯМИ

План

Программа

Способы сохранения генетической информации у микробов.

Модификационная изменчивость.

Мутационная изменчивость.

Рекомбинация ДНК.

Способы передачи генетической информации между бактериями — трансформация, трансдукция, конъ­югация.

Фаговая конверсия.

Сохранение и изменение генетической информации в микробных популяциях.

Демонстрация

S- и R-формы колоний у E.coli.

Таблицы со схемами передачи генетической информа­ции между бактериями в опытах трансформации,
трансдукции и конъюгации.

Задание студентам

Определить частоту образования рекомбинантов Leu⁺ в опыте конъюгации.

Определить частоту образования трансдуктантов (ре­комбинантов) в опыте трансдукции фагом A, dgai

Определить частоту образования трансформантов (ре­комбинантов) в опыте трансформации признака Str^r (стрептомицинрезистентности) у Bacillus subtilis.

Методические указания

Постановка опыта трансформации (рис. 6.1; на вклейке). Реципиент — штамм Bacillus subtilis Str⁵ (сенная палочка, чув­ствительная к стрептомицину); донор — ДНК, выделенная из

штамма B.subtilis Str^r (устойчивого к стрептомицину). Селек­тивная среда для отбора рекомбинантов (трансформантов) — питательный агар, содержащий 100 ЕД/мл стрептомицина. К 1 мл бульонной культуры B.subtilis добавляют 1 мкг/мл ДНК донора. Смесь инкубируют при 37 "С в течение 30 мин. Затем в пробирку вносят смесь 0,1 мкг/мл раствора ДНКазы в 0,5 мл раствора хлорида магния для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма, и выдержива­ют в течение 5 мин. Для определения количества образовав­шихся стрептомицинустойчивых рекомбинантов (трансфор­мантов) 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Для определения количества клеток реципиентной культуры в изотоническом растворе хлорида на­трия готовят 10-кратные разведения до 10~⁵— 10~⁶ (для полу­чения сосчитываемого количества колоний), высевают по 0,1 мл на питательный агар без стрептомицина, а для контроля — на агар со стрептомицином. На последней среде реципиентная культура не должна расти, поскольку она чувствительна к стрептомицину. Посев инкубируют при 37 °С. На следующий день учитывают результаты опыта и определяют частоту транс­формации по отношению количества выросших рекомбинант-ных клеток к числу клеток реципиентного штамма.

Допустим, что при высеве 0,1 мл культуры реципиентного штамма в разведении 10~⁵ выросло 170 колоний, а при высеве 0,1 мл нераз­веденной смеси — 68 колоний рекомбинантного штамма. Поскольку каждая колония образовалась в результате размножений только одной бактериальной клеткой, то в 0,1 мл засеянной культуры реципиента содержится 170хЮ⁵ жизнеспособных клеток, а в 1 мл — 170хЮ⁶, или 1,7х10⁸. В то же время в 0,1 мл смеси находится 68 рекомбинант-ных клеток, а в 1 мл — 680, или 6,8x10^. Таким образом, частота трансформации в данном опыте будет равна:

---

Постановка опыта специфической трансдукции (рис. 6.2; на вклейке). Реципиент — штамм E.coli lac, лишенный (3-галакто-зидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг — фаг Я. dgal, в геноме которого часть генов замещена р-галактозидазным опероном E.coli. Он явля­ется дефектным, т.е. не способен вызывать продуктивную ин­фекцию, заканчивающуюся лизисом кишечной палочки, и обозначается буквой d (фаг dgal) с названием содержащегося в его геноме бактериального оперона gal. Селективная среда — среда Эндо, на которой лактозоотрицательные бактерии реци­пиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозо-положительные колонии рекомбинантного штамма приобрета­ют красный цвет с металлическим оттенком. К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага dgal в концентрации 10⁶—10⁷ частиц в 1 мл. Смесь инкубируют при 37 °С в течение 60 мин, после чего готовят ряд 10-кратных разведений (в зависимости от предполагаемой концентрации бактерий) для получения сосчи­тываемого количества колоний. Из пробирки с разведением 10~⁶ делают высев по 0,1 мл культуры на 3 чашки Петри со средой Эндо и равномерно распределяют жидкость шпателем по поверхности среды. Посевы инкубируют в течение 1 сут, после чего отмечают результаты опыта и вычисляют частоту трансдукции по отношению количества клеток рекомбинантов (трансдуктантов), обнаруженных на всех чашках, к числу кле­ток реципиентного штамма.

Например, после посева 0,1 мл смешанной культуры в раз­ведении 10"~⁶ на 3 чашках со средой Эндо выросло соответст­венно 138, 170 и 160 бесцветных колоний реципиентного штамма, на первой и последней чашках — 5 и 1 колонии транс­дуктантов красного цвета. Следовательно, частота трансдукции в этом случае будет равна:

(5+1) х 10xlO<J ₌ 6 ₂

(38+170+160) х 10х10^б 468 '

Постановка опыта конъюгации с целью передачи фрагмента хромосомы, который содержит ген leu, контролирующий синтез лейцина (рис. 6.3; на вклейке). Донор — штамм E.coli K12 Hfr leu⁺ Str⁵; реципиент — штамм E.coli K12F~ leu⁺ Str^R. .Hfr — обозначение состояния, для которого характерна высокая час­тота рекомбинации. Селективная среда для выделения реком­бинантов — минимальная глюкозосолевая среда: КН^РС^ — 6,5 г, MgSO₄ - 0,1 г, (NH₄)₂S0₄ - 1 г, Ca(NO₃)₂ - 0,001 г, FeSO₄ -0,0005 г, глюкозы — 2 г, стрептомицина — 200 ЕД/мл, дистил­лированной воды — 1 л.

К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульонной культуры донора. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 30 мин. Затем смесь разводят до 10~²—10~³ и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки Петри, на которой вырастут только колонии рекомбинантов. В качестве контроля на ту же среду высевают донорныи и реципиентныи штаммы, которые не будут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрептомицину, а второй ауксотрофен по лейци­ну. Кроме того, культуру донорного штамма высевают на селек­тивную среду без стрептомицина, а культуру реципиентного штамма — на полную среду (питательный агар) с антибиотиками для определения числа жизнеспособных клеток. Посевы инкуби­руют при 37 °С до следующего дня. После подсчета числа вырос­ших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным. Например, после посева 0,1 мл смеси донорных и реципиентных культур в разведении 10~² выросло 150 колоний рекомбинантов, а после посева 0,1 мл культуры реципиента из разведения 10~⁶ — 75 колоний. Таким образом, частота рекомбинации будет равна:

---

150 х 10 х 100 _ 1,5 х 10^s _4

75х10хЮ⁶ ~7,5хЮ⁸ ' '

Глава 7 МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ.

ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕЙСТВИЯ АНТИСЕПТИКОВ И ДЕЗИНФЕКТАНТОВ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ К АНТИМИКРОБНЫМ ПРЕПАРАТАМ

Введение. Уничтожение патогенных для человека микробов является одной из важнейших проблем в профилактике и ле­чении различных заболеваний. Для борьбы с микробами ис­пользуют методы асептики, антисептики, дезинфекции и анти­микробной терапии. Каждый метод имеет свои особые цели и условия применения.

Тема 7.1. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ И ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

Введение. Асептика — система мероприятий, предупрежда­ющих внесение (попадание) микроорганизмов из окружающей среды в ткани или полости человеческого организма при ле­чебных и диагностических манипуляциях, а также в материал для исследования, в питательные среды и культуры микроор­ганизмов при лабораторных исследованиях. Асептика предус­матривает соблюдение особых санитарно-гигиенических пра­вил и приемов работы, а также специальную обработку инстру­ментов, материалов, рук медицинских работников, помещений и т.д. с целью частичного (дезинфекция) или полного (стери­лизация) уничтожения микробов.

Антисептика — комплекс лечебно-профилактических меро­приятий, направленных на уничтожение микроорганизмов, способных вызвать инфекционный процесс, на поврежденных участках кожи и слизистых оболочек, путем обработки микро-бицидными веществами — антисептиками.

Стерилизация — полное уничтожение микроорганизмов, включая вегетативные формы и споры. Существуют 3 основ­ные группы методов стерилизации: физические, механические и химические. Выбор метода, используемого для решения прак­тической задачи, зависит от стерилизуемого объекта.

Дезинфекция — обеззараживание объектов окружающей сре­ды. В отличие от стерилизации дезинфекция приводит к гибели большинства, но не всех форм микробов и, таким образом, обеспечивает только снижение микробной контаминации (за­грязнения), а не полное обеззараживание объекта. Поэтому предметы, подвергшиеся дезинфекции, не являются абсолютно безопасными.

План

Программа

Асептика, антисептика и дезинфекция. Антисептики и дезинфектанты.

Антимикробное действие физических и химических факторов.

Методы стерилизации; аппаратура, используемая для стерилизации.

Методы контроля эффективности стерилизации, дей­ствия антисептических и дезинфицирующих веществ.

Демонстрация

1. Аппаратура, используемая при стерилизации: авто­клав, сушильный шкаф, аппаратура для фильтрации и УФ-облучения.

Задание студентам

Учесть результаты опытов, поставленных с бактери­альными тест-объектами для контроля эффективности стерилизации, проведенной путем кипячения и автоклавирования. Сделать заключение.

---

Определить по готовым посевам антибактериальное действие УФ-лучей на стафилококки и кишечную па­лочку.

Учесть результаты опытов, поставленных для опреде­ления антимикробного действия антисептических и дезинфицирующих веществ. Сделать заключение.

Методические указания

• Методы стерилизации

I. Физические методы. Воздействие высоких темпе­ратур. Высокая температура обладает микробицидным действи­ем благодаря способности вызывать денатурацию важнейших биополимеров, в первую очередь белков.

Стерилизация сухим жаром в сушильно-стерилизационном шкафу (печи Пастера) основана на бактерицидном действии нагретого до 165—170 °С воздуха в течение 45 мин. При более высокой температуре происходит обугливание ватных пробок, бумаги, в которую завернута посуда, а при более низкой тем­пературе требуется большой срок стерилизации. Сухим жаром стерилизуют стеклянную посуду (чашки Петри, пробирки, пи­петки и др.).

Давление пара, атм Температура, "С Время стерилизации, мин 0 100 30—60 (дробно) 0,5 111 20-30 1 121 15-20 1,5 127 15-20 2 133 15

меняют ограниченно, например для стерилизации бактериоло­гических петель, препаровальных игл, пинцетов.

Воздействие ионизирующих излучений. Микроби-цидное действие ионизирующих излучений основано на их способности вызывать повреждения в молекуле ДНК. Для сте­рилизации одноразовых медицинских инструментов и бактери­ологического оборудования, чувствительного к термическим воздействиям (пластиковая посуда для культивирования мик­робов и клеточных культур, пластиковые шприцы, системы переливания крови и т.д.), обычно применяют стерилизацию у-изл учением.

II. Механические методы. Основаны на фильтровании через специальные мембранные фильтры с малым размером пор, способные механически задерживать микроорганизмы. В лабо­раторной практике широко применяют бумажные и полимер­ные фильтры. Существуют фильтры с порами различных, стро­го откалиброванных размеров, что позволяет гарантированно очищать материал не только от бактерий, но и вирусов, а при необходимости и от некоторых макромолекул. Фильтрование ис­пользуют для стерилизации жидких материалов, не выдержива­ющих нагревания (сыворотка крови, растворы антимикробных препаратов, компоненты питательных сред для бактерий и культур клеток), для получения бактериальных токсинов и других продуктов жизнедеятельности бактерий. Фильтрование является ведущим методом стерилизации воздуха в тех случаях, когда это необходимо. Для этого воздух пропускают через фильтры, пропитанные микробицидными веществами. Такие системы стерилизации применяют, например, в настольных боксах для работы с возбудителями особо опасных инфекций, а также в операционных блоках, родильных отделениях и т.д.

---

III. Химические методы. Основаны на обработке объекта химическими веществами, обладающими микробицидным дей­ствием и способными при соблюдении определенных режимов воздействия обеспечить полное уничтожение микрофлоры. Хи­мическую стерилизацию обычно применяют для обработки различных приборов и инструментов многоразового использо­вания, чувствительных к высоким температурам (фиброоптические приборы, медицинские имплантаты и др.). К стерилизу­ ющим агентам относятся окись этилена, перекись водорода, глютаровый альдегид, пероксиуксусная кислота, двуокись хлора.

Независимо от метода во всех случаях требуется регулярный контроль эффективности процедуры стерилизации. С этой целью используют биологические индикаторы — известные микроор­ганизмы, наиболее устойчивые к данному способу обработки (например, споры Bacillus stearothermophilus для контроля эф­фективности автоклавирования, Bacillus subtilis — для контроля сухожаровой стерилизации). Существуют также физико-хими­ческие индикаторы — вещества, которые претерпевают видимые изменения (изменяют цвет, агрегатное состояние и т.д.) только при соблюдении правильного режима обработки.

• Методы дезинфекции

Для дезинфекции применяют физические и химические ме­тоды.

I. Физические методы. Воздействие высоких темпера­тур.

Кипячение. Шприцы, мелкий хирургический инструмента­рий, предметные и покровные стекла и некоторые другие пред­меты помещают в стерилизаторы, в которые наливают воду. Для устранения жесткости и повышения температуры кипяче­ния к воде добавляют 1—2 % раствор бикарбоната натрия. Кипячение производят не менее 30 мин. При кипячении не­которые вирусы (например, вирус гепатита В) и споры бакте­рий сохраняют жизнеспособность.

Пастеризация основана на антибактериальном действии температуры в отношении вегетативных клеток, но не бакте­риальных спор. Нагревание материала производится при тем­пературе 50—65 °С в течение 5—10 мин с последующим бы­стрым охлаждением. Обычно пастеризуют напитки и пищевые продукты (вино, пиво, соки, молоко и др.).

Воздействие ионизирующих излучений. Ультрафи­олетовое излучение (УФ) с длиной волны 260—300 мкм обладает достаточно выраженным микробицидным действием, однако некоторые виды микробов и споры резистентны к УФ. Поэто­му УФ-облучение не способно обеспечить полного уничтоже­ния микрофлоры — стерилизацию объекта. Обработку УФ обыч­но используют для частичного обеззараживания (дезинфекции) крупных объектов: поверхностей предметов, помещений, воз­духа в медицинских учреждениях, микробиологических лабо­раториях и т.д.

Гамма-излучение обладает выраженным микробицидным дей­ствием на большинство микроорганизмов, включая вегетатив­ные формы бактерий и споры большинства видов, грибы, виру­сы. Применяют для стерилизации пластиковой посуды и меди­цинских инструментов одноразового использования. Следует иметь в виду, что обработка гамма-излучением не обеспечивает уничтожения таких инфекционных агентов, как прионы.

---

Смотрите также файлы

• ГИПЕРТЕНЗИЯ, Эклампсия.doc

• ДИВ.doc

• ВЗРП.doc

• Внутриутробная задержка развития плода.doc

• Антенатальный 20уход_24Nov[1].doc