Файл: Особенности приготовления.docx

Этиловый спирт. Применяют как Абсолютный, так и 96 "а спирт. Абсолютный спирт обладает преимуществом: благодаря резко выраженному коагулируюшему действию менее деформирует клеточные элементы. Но спирт имеет меньшую проникающую способность, чем формалин, поэтому кусочки костной ткани должны быть толщиной не более 0,5 см. Спиртовая фиксация, как правило, применяется в специальных случаях, например, для различных гистохимических методов при исследовании на соли кальция. Объект помещают в спирт на 12—24ч, который за это время нужно 2—3 раза сменить.

Спирт с формалином (спирт-формол). Смесь готовят перед применением: 1 часть 10 % нейтрального формалина + 9 частей 96 % этилового спирта.

Кусочки кости фиксируют в течение 24 ч, а затем помещают в 96 % или 100 % спирт.

Жидкость Карнуа. Смесь содержит 6 частей 100 % спирта, 3 части хлороформа и 1 часть ледяной уксусной кислоты. Применение этой жидкости показано в тех случаях, когда необходимо ускорить исследование. Соединительная ткань при фиксации слегка сморщивается. Кусочки костной ткани толщиной 2 до 4 мм фиксируют от 2 до 3—4ч, а затем переносят в 100 спирт.

Жидкость Боуэна. Смесь готовят из насыщенного раствора пикриновой кислоты (15 частей), 40 % раствора формальдегида (5 частей) ледяной уксусной кислоты (1 часть). Жидкость быстро проникает в фиксируемые объекты, вызывая незначительное сморщивание соединительной ткани. Фиксацию проводят в течение 1 суток, затем кусочки тщательно промывают в проточной воде (не менее 24 ч) и проводят через спирты возрастающей концентрации, которые повторно меняют, чтобы, по возможности, устранить желтую окраску ткани.

Смесь сулемы с формалином. Эту фиксирующую смесь готовят из 9 частей насыщенного водного раствора сулемы и 1 части 40 % формальдегида. Смесь считается очень хорошим фиксатором для органов, богатых соединительной тканью. Продолжительность фиксации в жидкостях 2—24 ч. При фиксации в жидкостях, содержащих сулему, в препаратах обычно образуются кристаллические или аморфные преципитаты. Для их удаления к 70—80 % спирту, служащему для промывания кусочков сразу же после фиксации, добавляют несколько капель 3 % спиртового раствора йодата калия. Материал выдерживают в этом растворе 24 ч — ткань должна приобрести коричневый оттенок. Если кусочки обесцвечиваются

---

, нужно увеличить в растворе концентрацию йода. Затем из материала удаляют йод при помощи 0,25 % раствора тиосульфата натрия и промывают в дистиллированной воде.

Фиксирующая смесь «Суза» по Гейденгаину. В начале 4,5 г сулемы и 0,5 г хлорида натрия растворяют при нагревании в 80 мл дистиллированной воды, затем к раствору добавляют 2 г трихлоруксусной кислоты, 4 мл ледяной уксусной кислоты и 20 мл 40 % формальдегида. Это одна из лучших фиксирующих смесей, одновременно обладающая декальцинирующим эффектом. Кусочки костной ткани, фиксируемой в смеси «Суза», должны быть не более 1 см. Фиксация продолжается от 3 до 24 ч в зависимости от величины исследуемого материала. Промывают материал в 96 % или 100 % спирте. Применение спирта меньшей концентрации нежелательно, так как при этом возможно чрезмерное набухание соединительной ткани. Далее кусочки обрабатывают в спиртовом йодо-йодокалиевом растворе.

Фиксирующая смесь «Супиформеис» по Пфулю. Смесь состоит из 40 мл концентрированного водного раствора сулемы, 20 мл 40 % формальдегида, 5 мл ледяной уксусной кислоты и 40 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты. Эта смесь обладает очень хорошими фиксирующими свойствами, применение ее не вызывает сморщивания исследуемого материала. Продолжительность фиксации кусочков костной ткани 12—24 ч. Затем следуют промывание в 80 % спирте и обработка в спиртовом йодо-йодокалиевом растворе.

Жидкость Гелли (ценкер-формол). Непосредственно перед применением к исходному раствору Ценкера вместо ледяной уксусной кислоты добавляют 5 мл формалина. Кусочки костной ткани фиксируют от нескольких до 24 ч, затем промывают в проточной воде в течение 24 ч.

Фиксирующая смесь «Саномия». Смесь состоит из 3 г сульфосалициловой кислоты, 5 мл ледяной уксусной кислоты и 100 мл 100 % спирта. Является очень хорошим общим фиксатором, не вызывающим сморщивание материала. Смесь приготавливают непосредственно перед использованием. Фиксацию необходимо проводить в темноте в течение 3—12 ч, материал промывают в 100 % спирте.

---

5.2 Декальцинация костного материала

В период становления гистологической техники для демонстрации применяли шлифованные распилы кости. Однако этот метод оказался малопригодным для гистологических исследовании, так как в этих очень толстых срезах была плохо различима структура костной ткани и при шлифовании разрушались клеточные элементы. Для получения гистологических срезов костной ткани необходимо растворить соли кальция, т.е. декальцинировать материал, сохранив клеточный элемент и органический матрикс кости.

Декальцинацию проводят после полной фиксации ткани, обычно в некислых фиксаторах. После декальцинации в кислотах необходимо проводить деацидификацию с помощью щелочных растворов или по крайней мере путем промывания в двух сменах спирта. Нельзя допускать длительного промывания в проточной воде, так как это способствует набуханию коллагеновых волокон, особенно если промывание проводится сразу после обработки в кислых растворах.

При проведении декальцинации надо учитывать следующие положения:

Продолжительность декальцинации в кислотах должна быть по возможности уменьшена, так как при длительном воздействии кислоты ухудшается способность тканей окрашиваться. В связи этим декальцинации подвергают небольшие и тонкие кусочки костной ткани (толщиной 0,5— 1 см).

С целью уменьшения продолжительности декальцинации необходимо брать большое количество декальцинирующей жид. кости (ее объём должен в 25—50 раз превосходить объем всех вместе взятых декальцинируемых кусочков костной ткани), чаще менять ее (каждые 24—48 ч) и встряхивать сосуд, в котором протекает реакция.

Продолжительность декальцинации не может быть установлена заранее, так как содержание солеи кальция в декальцинируемой ткани может колебаться в очень широких пределах. Критерии окончания декальцинации — см. ниже.

Если декальцинацию проводили с помощью трихлоруксусной и пикриновой кислот, то кусочки промывают 80—90 % спиртом, после декальцинации неорганическими кислотами их промывают водой. В последнем случае во избежание набухания соединительной ткани перед промыванием объект необходимо на 24 ч поместить в жидкость, уменьшающую набухание, например в 5 % раствор алюмокалиевых квасцов. Затем следует тщательно промыть материал в проточной воде в течение 24—48 ч.

---

Если декальцинируемая ткань содержит много жира (костный мозг), то ее необходимо предварительно обезжирить, выдерживая объект несколько дней в 96 % и 100 % спиртах, лучше в термостате при 37 °С.

06'ьекты небольших размеров или такие, в которых костная ткань имеет тонкую структуру, можно предварительно залить в целлоидин.

Процессе декальцинации протекает быстрее в термостате при 37 °С, однако кислотная декальцинация в этих условиях обычно сопровождается возникновением различных артефактов.

После декальцинации кусочки кости можно резать на замораживающем микротоме или залить в парафин или целлоидин.

В зависимости от используемых реагентов различают кислотную и безкислотную декальцинацию.

Кислотная декальцинация

Минеральный компонент костной ткани в основном представлен кристаллами нерастворимого гидроксиапатита. С тем чтобы удалить это вещество из кости, его приводят в растворимое состояние в декальцинирующих растворах, обладающих высокой кислотностью. Используются азотная, сернистая, муравьиная, трихлоруксусная, пикриновая кислоты и жидкости различного состава.

Азотная кислота. Для декальцинации применяют 5—7,5% водный раствор азотной кислоты. Для его приготовления в мензурку с притертой пробкой наливают 5—7,5 мл химически чистой концентрированной азотной кислоты (плотность 1,40) и добавляют до 100 мл дистиллированную воду. В оптимальных условиях небольшие кусочки самой плотной кости декальцинируются в растворе азотной кислоты уже через 10 ч. После декальцинации для подавления набухания соединительной ткани кусочки кости на 24 ч подвешивают в 5 % растворе сульфата натрия или лития и лишь после этого промывают в течение 24— 48 ч в проточной воде.

Не рекомендуется применять растворы азотной кислоты как более низкой, так н более высокой концентрации: в первом случае происходит набухание, во втором — повреждение клеточных структур. При этом в более концентрированном растворе кислоты значительно усиливается ее декальценирующее действие.

Сернистая кислота. Под воздействием сернистой кислоты нерастворимый в воде третичный фосфат кальция переходит в легко растворяющийся в воде первичный фосфат кальция. Для декальцинации используют насыщенный 5% водный раствор сернистой кислоты. Предварительную фиксацию кусочков кости лучше проводить формалином, а не растворами, содержащими сулему. Сернистая кислота обеспечивает быструю и равномерную декальцинацию в течение 5—8 дней.

---

Муравьиная кислота. Для декальцинации применяют концентрированную муравьиную кислоту, разбавленную равным количеством 70 % спирта или 10-15 % раствором формалина.

Материал перед этим должен быть хорошо фиксирован в формалине. После декальцинации, кусочки кости промывают в течение нескольких дней в часто сменяемом 70 % спирте или 10— 15 % растворе формалина, что позволяет избежать сильного набухания тканей. Муравьиную кислоту особенно рекомендуют использовать для декальцинации зубов. Она мало влияет на окрашиваемость срезов костной ткани.

Трихлоруксусная кислота. Обычно применяют 5— 10 % водный раствор этой кислоты, который одновременно фиксирует материал. К этому раствору целесообразно добавлять 10—20 % раствор формалина. Декальцинацию в трихлоруксусной кислоте рекомендуется проводить после предварительной фиксации в формалине, жидкости Боуэна. Для декальцинации небольших кусочков достаточно 1—4 дней. Материал промывают в 96 % спирте в течение 3—4 дней при ежедневной его смене. Для промывания ни в коем случае нельзя использовать воду, что приводит к очень сильному набуханию соединительной ткани.

Пикриновая кислота. Концентрированный водный раствор кислоты применяют для декальцинации эмбриональных объектов и костей мелких животных, поскольку процессе декальцинации в ней проходит очень медленно (от одного до нескольких месяцев). Материал промывают в 70—80 % спирте во избежание набухания соединительной ткани, а также потому, что образующиеся под воздействием пикриновой кислоты осадки большей частью нерастворимы в воде. Клеточные структуры тканей способность окрашиваться сохраняются очень хорошо.

Жидкость Виленсона (кислотно-формалино-солевой раствор). Эта жидкость состоит из 10 % раствора азотной кислоты, приготовленного на 5 % формалине с добавлением ацетата калия из расчета 5 г на каждые 100 мл декальцинирующего раствора. Продолжительность декальцинации в этом растворе значительно меньше, чем в других реагентах, при этом способность тканей окрашиваться не ухудшается.

Жидкость ван-Эбнера. Она имеет следующий состав: 10— 15 г хлорида натрия, 2 мл соляной кислоты (плотность 1,19) и 100 мл дистиллированной воды. Декальцинирующее действие оказывает соляная кислота. Хлорид натрия главным образом противодействует разбуханию коллагеновых волокон. Кусочки кости оставляют в этой жидкости на несколько недель и даже месяцев, в течение которых нужно ежедневно добавлять 1-2 мл соляной кислоты для сохранения первоначальной концентрации или ежедневно менять декальцинирующую жидкость. По окончании декальцинации кусочки промывают в проточной воде, затем переносят для нейтрализации в ежедневно сменяемый 10—15 % раствор хлорида натрия.

---