Этапы приготовления мазка:

1. 
   Собственно приготовление мазка.
   
2. 
   Высушивание.
   
3. 
   Фиксация.
   
4. 
   Окрашивание.
   

1. 
   Собственно приготовление мазка:
   

• 
  из культуры бактерий, выращенной в жидкой питательной среде:
  
  • 
    обезжирить предметное стекло;
    
  • 
    нанести на стекло с помощью бактериологической петли каплю культуры и распределить ее параллельными движениями;
    
• 
  из культуры бактерий, выращенной на плотной питательной среде:
  
  • 
    на обезжиренное стекло нанести каплю физиологического раствора, затем внести в эту каплю петлей небольшое количество культуры бактерий с плотной питательной среды и распределить параллельными движениями.
    

Высушивание мазка на воздухе или высоко над пламенем спиртовки (в струе теплого воздуха).

Фиксация мазка: жаром, в пламени спиртовки – при изучении формы и расположения бактерий и дифференциации их при окраске сложным методом;

химическим методом – при изучении нативных (сохранивших естественную

структуру) препаратов от больного (кровь, ликвор, гной и т.д.). В качестве химических фиксаторов чаще используют этиловый и метиловый спирт, а также смесь Никифорова (смесь этилового спирта и эфира в соотношении 1:1).

Цель фиксации:

• 
  убить микроорганизмы;
  
• 
  прикрепить их к предметному стеклу;
  
• 
  улучшить их прокрашивание.
  

6.Виды микроскопии, используемые в медицинской микробиологии.

СВЕТОВОЙ МИКРОСКОП. Разрешающая способность 0,2 мкм.

Предназначен для изучения формы, размеров и структуры окрашенных клеток.

При исследовании микроорганизмов применяют иммерсионный объектив. Его преимущество – с помощью иммерсионного масла устанавливается оптически однородная среда с одинаковым показателем преломления между стеклом и линзой. Благодаря этому все лучи, не преломляясь и не изменяя направления, попадают в объектив, чем достигается более высокая разрешающая способность. В качестве иммерсионного масла обычно используют кедровое или касторовое, показатель преломления которых равен показателю преломления света в стекле.

ТЕМНОПОЛЕВОЙ МИКРОСКОП (ультрамикроскоп). Разрешающая способность – 0,02-0,04 мкм.

Предназначен для изучения формы, размеров и подвижности живых, неокрашенных бактерий.

Темное поле

---

создается с помощью специального конденсора, в котором затемнена центральная часть и таким образом создается боковое освещение. Поэтому в объектив попадают лучи, отраженные от объекта. Увеличение разрешающей способности микроскопа связано с тем, что отраженный луч имеет более короткую длину волны.

ФАЗОВО-КОНТРАСТНЫЙ МИКРОСКОП. Разрешающая способность – 0,2 мкм.

Предназначен для изучения формы, подвижности и структуры живых неокрашенных бактерий.

Имеет специальный набор фазовых объективов и соответствующих им кольцевых диафрагм конденсора. С помощью этого устройства достигается преобразование невидимых фазовых колебаний преломленного луча в видимые амплитудные колебания.

ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МИКРОСКОП. Разрешающая способность – 0,2 мкм.

Предназначен для экспресс-диагностики вирусных и бактериальных инфекций.

Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых ультрафиолетовых (УФ) лучей. Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными люминесцентными красителями – флуорохромами (акридиновый оранжевый, аурамин и др.). В качестве источника УФ-света обычно используют ртутнокварцевую лампу. Под действием УФ-излучения окрашенные клетки начинают светиться красным или зеленым светом.

ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП. Разрешающая способность – менее 1Å (Å – ангстрем).

Предназначен для изучения строения вирусов, бактерий и отдельных макромолекул.

Высокая разрешающая способность достигается малой длиной волны электронов. В электронном микроскопе вместо света используют поток электронов в безвоздушной среде. Источником электронов является вольфрамовая нить катода, разогреваемая до высокой (2500-2900⁰С) температуры. Роль оптических линз выполняют электромагниты. Для исследования препаратов в электронном микроскопе применяют специальные пленки, проницаемые для электронов.

7. Окраска по Граму. Механизм окраски. Примеры грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Окраска по Граму (в модификации Синѐва):

• 
  на фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, пропитанную генциан-фиолетовым, смачивают водой, окрашивают 2 минуты;
  
• 
  снимают бумагу и наносят на мазок раствор Люголя на 1 минуту, затем краситель сливают;
  
• 
  обесцвечивают мазок 96^о спиртом 10-15 секунд;
  
• 
  промывают мазок водой;
  
• 
  докрашивают мазок фуксином Пфейффера 30 секунд;
  
• 
  промывают мазок водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.
  

---

Механизм окраски по Граму.

Дифференцировка на грамположительные и грамотрицательные бактерии зависит от строения клеточной стенки, основой которой является пептидогликан. У грамположительных бактерий толщина пептидогликана 500Å, у грамотрицательных – не более 150Å.

При окрашивании препарата генциан-фиолетовым, а затем раствором Люголя, образуется комплекс генциан-фиолетовый + йод. Все клетки окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. При обработке спиртом у грамположительных бактерий образовавшийся комплекс не обесцвечивается. Поэтому при окрашивании фуксином Пфейффера они сохраняют сине-фиолетовый цвет. У грамотрицательных бактерий комплекс генциан-фиолетовый + йод обесцвечивается спиртом и при окраске фуксином Пфейффера они приобретают розово-красный цвет.

В результате окраски бактерии дифференцируют на грамположительные (сине-фиолетовые) или грамотрицательные (розово-красные).

К грамположительным относят все кокки (кроме нейссерий) и спорообразующие бактерии. К грамотрицательным – нейссерии, неспорообразующие бактерии, спириллы.

8. Оболочечные структуры бактериальной клетки, их функции. L-формы бактерий.

К оболочечным структурам бактериальной клетки относят капсульный слой, клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану.

Снаружи многие бактерии имеют КАПСУЛЬНЫЙ СЛОЙ (МИКРОКАПСУЛУ). Это слизистое образование, не превышающее диаметр бактериальной клетки. У некоторых бактерий имеется ИСТИННАЯ КАПСУЛА – слизистый слой, превышающий диаметр бактериальной клетки. Капсула не является обязательной структурой. У большинства бактерий она имеет полисахаридную природу. У некоторых (Bacillus anthracis) – состоит из белка.

Большинство бактерий образуют капсулу только в макроорганизме

(in vivo): Streptococcus pneumoniaе – возбудитель крупозной пневмонии;

Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы;

Clostridium perfringens – возбудитель газовой гангрены;

Francisella tularensis – возбудитель туляремии;

Yersinia pestis – возбудитель чумы.

Некоторые бактерии образуют капсулу в макроорганизме и на питательной среде (in vivo и in vitro):

Klebsiella pneumoniaе – возбудитель пневмонии;

Klebsiella oxytoca– возбудитель сепсиса, инфекций мочевыводящих путей;

---

Klebsiella granulomatis – возбудитель паховой гранулемы.
Функции капсулы:

• 
  в макроорганизме защищает бактерии от фагоцитоза и действия антител;
  
• 
  во внешней среде предохраняет бактерии от высыхания.
  

Капсулу выявляют в окраске по Бурри-Гинсу. В результате окраски бактерии красного цвета, вокруг них бесцветные капсулы на черно-розовом фоне.

---

КЛЕТОЧНАЯ СТЕНКА представляет собой биополимер – пептидогликан (муреин), являющийся плотной структурой. По строению клеточной стенки грамположительные и грамотрицательные бактерии существенно отличаются друг от друга (см. занятие №2).

Функции клеточной стенки:

• 
  придает клетке постоянную форму;
  
• 
  защищает клетку от механических повреждений извне и выдерживает значительное внутреннее давление;
  
• 
  участвует в транспорте метаболитов;
  
• 
  несет на своей поверхности рецепторы для бактериофагов (вирусов бактерий) и различных химических веществ.
  

L-формы бактерий, их медицинское значение.

L-формы (от названия Института им. Д. Листера, где они впервые были изучены) – это бактерии, полностью или частично лишенные клеточной стенки, но способные к размножению. Имеют своеобразную морфологию в виде крупных и мелких сферических клеток.

L-трансформации могут подвергаться все бактерии, имеющие клеточную стенку.

L-трансформация происходит под действием различных индуцирующих факторов (антибиотики, угнетающие биосинтез клеточной стенки, лизоцим и др.). В результате бактерии становятся устойчивыми к некоторым антибиотикам.

L-трансформация может быть обратимой и необратимой. Обратимая – наблюдается при сохранении генетического контроля синтеза клеточной стенки и тогда бактерии реверсируют в исходную форму.

L-формы могут образовывать многие возбудители инфекционных заболеваний. Это одна из причин хронизации заболеваний и форм приспособления бактерий к неблагоприятным условиям существования.

ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ МЕМБРАНА (ЦПМ) располагается под клеточной стенкой. Представляет собой трехслойную мембрану. Состоит из двойного слоя липидов и белков, пронизывающих липидные слои.

Функции ЦПМ:

• 
  является основным осмотическим и онкотическим барьером;
  
• 
  участвует в энергетическом метаболизме и активном транспорте питательных веществ в клетку, т.к. является местом локализации пермеаз и ферментов окислительного фосфорилирования;
  
• 
  участвует в процессах дыхания и деления;
  
• 
  участвует в синтезе компонентов клеточной стенки (пептидогликана); - участвует в выделении из клетки токсинов и ферментов.
  

ЦПМ выявляется при электронной микроскопии.

9. 
   Особенности строения клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий. Окраска по Цилю-Нильсену, механизм окраски.
   

---

Смотрите также файлы

• Спасает любимое животное. Героя не страшит опасность он в одиночку спускается в колодец и достает из него Жучку, которую бросил туда злой человек. (Предложения 32 34.) Мальчик считает, что делает доброе дело, за которое мама с папой его обязательно похва.docx

• Исследовательская работа Производная в жизни человека Авторы Андреева Н. В. с. Красноармейское 2015 Содержание I. Введение. Ii. История производной.docx

• Этапы разработки программного обеспечения. Стадия Техническое задание.docx

• Брак и семья общее и различное.pptx

• Закон рф от 29 ноября 2010 года 326 фз регулирует отношения в сфере обязательного медицинского страхования добровольного медицинского страхования обязательного и добровольного медицинского страхования.docx