Файл: Курс лекций, нгу 2000. Лекция Что такое молекулярная биология. Доказательства роли нуклеиновых кислот.doc

Определение: аминоацилирование - это образование связи между аминокислотой и tPHК.

Следующий этап трансляции - собственно синтез полипептидов, происходит на рибосомах.

Структура рибосом

Рибосомы - немембранные самые мелкие клеточные органеллы, при этом они едва ли не самые сложные. В клетке E. сoli присутствует около 10³-5х10³ рибосом. Линейные размеры прокариотической рибосомы 210 х 290 Å. У эукариот - 220 х 320 Å.

Выделяют четыре класса рибосом:

1. Прокариотические 70S.

2. Эукариотические 80S.

3. Рибосомы митохондрий (55S - у животных, 75S - у грибов).

4. Рибосомы хлоропластов (70S у высших растений).
Определение: S - коэффициент седиментации или константа Сведберга. Отражает скорость осаждения молекул или их компонентов при центрифугировании, зависящую от конформации и молекулярного веса.
Каждая рибосома состоит из 2-х субъединиц (большой и малой).

Прокариотическая рибосома		Эукариотическая рибосома
70S		80S
50S	30S	60S	40S
5S rРНК 23S rРНК	16S rРНК	5S rРНК 5.8S rРНК 28S rРНК	18S rРНК
34 молекулы белков, из них 31 разные	21 белок	не менее 50 разных белков	не менее 33 разных белков

Сложность объясняется тем, что все элементы рибосом представлены в одном экземпляре, за исключением одного белка, присутствующего в 4 копиях в 50S субъединице, и не могут быть заменены.
rРНК выполняют не только функцию каркасов субъединиц рибосом, но и принимают непосредственное участие в синтезе полипептидов.

23S rРНК входит в каталитический пептидилтрансферазный центр, 16S rРНК необходима для установки на 30S субъединице инициирующего кодона mРНК, 5S rРНК - для правильной ориентации аминоацил-tРНК на рибосоме.

---

Все rРНК обладают развитой вторичной структурой: около 70% нуклеотидов собрано в шпильки.

rРНК в значительной степени метилированы (СН₃-группа во втором положении рибозы, а также в азотистых основаниях).
Порядок сборки субъединиц из rРНК и белков строго определен. Субъединицы, не соединенные друг с другом, представляют собой диссоциированные рибосомы. Соединенные - ассоциированные рибосомы. Для ассоциации нужны не только конформационные изменения, но и ионы магния Mg²⁺ (до 2х10³ ионов на рибосому). Магний нужен для компенсации отрицательного заряда rРНК. Все реакции матричного синтеза (репликация, транскрипция и трансляция) связаны с ионами магния Mg²⁺ (в меньшей степени - марганца Mn²⁺).

Каталитические центры рибосом

Асп - центр специфического узнавания. Здесь происходит взаимодействие кодон-антикодон. Р-центр - пептидильный, донорный. Он является донором формилметионина при инициации, или пептидила при элонгации трансляции. А-центр - аминоацильный, акцепторный. Акцептирует формилметионин в самом начале или пептидил при элонгации трансляции. К-центр - каталитический (фермент пептидилтрансфераза). В К-центре задействована 23S rРНК и несколько белков большой субъединицы.

Синтез полипептидов на рибосоме

У прокариот перед каждым геном и соответственно в mРНК перед копией каждого гена имеется лидерная последовательность.

Она может быть разного размера (до 160 нукл.) и разной первичной структуры, но обязательно содержит полипуриновую последовательность Шайна-Дальгарно, которая комплементарна 3'-концевому участку 16S rРНК. Комплементарными могут быть 3-9 нуклеотидов.

Назначение комплементарного взаимодействия 3'-концевого участка 16S rРНК и последовательности Шайна-Дальгарно - правильная установка инициирующего кодона AUG на малой субъединице рибосомы.
Инициирующий кодон находится на растоянии 3-10 нукл. от

---

последовательности Шайна-Дальгарно.

К малой субъединице, на которой уже находится mРНК, подходит формилметиониновая tРНК, соединенная с формилметионином. В результате образуется инициаторный комплекс: 30S субъединица рибосомы + mРНК + формилметионовая tРНК-формилметионин. Затем происходит ассоциация рибосомы. При этом изменяется конформация 16S rРНК и нарушается связь между ней и последовательностью Шайна-Дальгарно.

Аминоацильный конец формилметиониновой tРНК оказывается в Р-центре. Второй кодон гена оказывается в Асп-центре. Соответствующая ему аминоацил-tРНК устанавливается таким образом, что ее аминоацильный конец попадает в А-центр.

Пептидилтрансфераза отрывает формилметионин в Р-центре и переносит его в А-центр. Образуется пептидная связь между формилметионином и аминоацил-tРНК.

Рибосома претерпевает конформационные изменения и сдвигается на один кодон. Формилметиониновая tРНК покидает рибосому. Второй кодон оказывается напротив Р-центра. Сюда же переходит tРНК, несущая на хвосте дипептид. В Асп-центр попадает третий кодон, а в А-центр очередная аминоацил-tРНК.

Теперь в Р-центре отрывается дипептид, переносится в А-центр и соединяется с третьей аминоацил-tРНК. Так продолжается до тех пор, пока в Асп-центр не приходит терминирующий кодон. Полипептид отрывается в Р-центре, переносится в А-центр и, т.к. присоединиться ему не к чему, он отваливается от рибосомы. Рибосома диссоциирует и малая субъединица сканирует mРНК.

---

In vivo на каждой стадии (образования инициаторного комплекса, инициации, элонгации и терминации) участвуют различные белковые факторы, которые препятствуют посадке на рибосому деацилированных tРНК или запрещают посадку формилметиониновой-tРНК в А-центр.

На всех этапах принимают участие молекулы ГТФ, которые дефосфорилируются.

Смысл гидролиза ГТФ не в отдаче энергии, а в свидетельстве того, что данный этап трансляции пройден.

Все синтезируемые полипептиды прокариот на N-конце несут формилметионин. В 20% случаев он отщепляется, а в 80% отщепляется только формильная группа и на N конце остается метионин.

Регуляция образования рибосомных РНК и белков рибосом E.сoli

Ежеминутно в E.сoli образуется около 500 рибосом.

Имеется 7 оперонов, в которых закодированы rРНК (всего 3 разных rРНК х 7оперонов = 21 ген). В формировании рибосом участвуют 52 различных белка, а значит 52 гена, их кодирующих. В итоге,

73 гена должны работать координированно, чтобы не было избытка белков или rРНК.
Вначале образуется про-rРНК, которая метилируется и процессируется (т.е. "созревает").

Количество rРНК регулируется количеством рибосомных оперонов, скоростью их транскрипции и работой ферментов метилаз и эндонуклеаз.
Имеется 7 разных оперонов, в которых закодированы рибосомные белки. Регуляция каждого из них осуществляется отдельно.

-оперон регулируется белком S4.

Если в клетке имеется свободная 16S rРНК, то S4 связывется с ней (1). Если же 16S rРНК не хватает, то он связывается с mРНК, считывающейся с данного оперона (2). Причем связывается в районе лидера и тем самым мешает трансляции.

---

Таким образом, осуществляется регуляция на уровне трансляции.
Оперон S10 регулируется белком L4.

РНК-полимераза синтезирует первую лидерную последовательность, длиной 140 нукл. Если 23S rРНК не хватает (2), то белку L4 не с чем соединяться, и он взаимодействует с лидерной последовательностью, придавая ей такую конформацию, которая не позволяет РНК-полимеразе продолжать транскрипцию. В результате синтез mРНК обрывается на первом же лидере (2).

Регуляция на уровне транскрипции.
Оперон .

В этом опероне закодированы белки, имеющие принципиальное значение для инициации транскрипции ( - фактор), инициации репликации (dna G - праймаза) и инициации трансляции (белок S21). Каждый белок нужен в разном количестве. S21 50000 копий, dnaG 50, - фактор 5000. Между геном S21 и геном dnaG есть слабый терминатор транскрипции. Ген dnaG имеет инициирующий кодон ГУГ (а не АУГ), который гораздо хуже узнается рибосомой и реже, чем АУГ инициирует трансляцию.

Аттенуация (ослабление)

Рассмотрим систему аттенуации на примере триптофанового оперона E.сoli.
Этот оперон регулируется по схеме негативной репрессии.
При недостатке в клетке триптофана оперон открыт. При увеличении концентрации триптофана РНК-полимераза не доходит даже до первого цистрона.

Между оператором и первым цистроном есть протяженный участок (162 п.н.), который содержит последовательность Шайна-Дальгарно. Она расположена ближе к цистрону, все остальное же представляет собой аттенуатор.

В этом районе происходит прекращение транскрипции и отсоединение РНК-полимеразы от ДНК. Это сделано для того, чтобы остановить РНК-полимеразу, которая уже в пути, в том случае, если концентрация триптофана в клетке к этому моменту повысилась.

В аттенуаторе выделяют 4 последовательности, частично комплементарные друг другу. В последовательности 1 закодирован 14-и членный пептид (Met-Lys-Ala-Ile-Phe-Val-Leu-Lys-Gly-Trp-Trp-Arg-Thr-Ser). На 10-ом и 11-ом месте в нем стоит триптофан.

---