ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 30.10.2019
Просмотров: 4038
Скачиваний: 33
Например, для вьщеления вирусов Коксаки заражают мышат-
сосунков. Вследствие дороговизны этот метод используется
редко. Наибольшее значение животные модели имеют для
изучения особенностей патогенеза и формирования иммунных
реакций при вирусных инфекциях.
ИНДИКАЦИЯ ВИРУСОВ
Индикацию вирусов
- качественное определение факта
наличия вируса в зараженном им материале проводят, регистрируя его
биологическую
активность
по
тем
эффектам,
которые
свидетельствуют о размножении в культурах клеток, куриных
эмбрионах либо в животных моделях.
Так, размножение вирусов в чувствительных клетках
in vitro
(в культуре) можно определить по цитопатическим эффектам
(таким как бляшкообразование, нарушения морфологии клеток
монослоя, появление в клетках включений, гибели клеток,
проявление феномена гемадсорбции, «цветной реакции»).
Бляшкообразование — это появление негативных колоний -
участков
разрушенных
клеток,
выглядящих
как
зоны
просветления в монослоях клеток, покрытых слоем агара
(рис.37).
Рис.37.
Бляшкообразование в культуре клеток
Примером нарушения морфологии клеток монослоя может
быть, например, размножение парамиксовирусов в культуре
клеток,
которое
сопровождается
появлением
характерных
гигантских многоядерных клеток.
98
Феномен гемадсорбции - появление у заражённых вирусами
клеток способности адсорбировать на своей поверхности
эритроциты. Феномен гемадсорбции имеет общие механизмы с
гемагглютинацией и проявляется на ранних сроках развития
инфекции, еще до проявления цитопатического эффекта.
«Цветная реакция» по принципу постановки сходна с
«цветными» реакциями, которые применяются в бактериологии,
только в данном случае индикатор вносят в культуральную
среду, используемую для
поддержания
культуры
клеток,
инфицированных вирусом. Обычно рост жизнеспособных клеток
сопровождается накоплением метаболитов, сдвигом pH среды и
изменением окраски индикатора. Заражение же культур вирусом
резко ингибирует клеточный метаболизм, и среда сохраняет
первоначальный цвет.
Применение
электронной микроскопии
делает возможным
непосредственное выявление и изучение морфологии вирусов.
Однако метод является малодоступным ввиду необходимости
использования электронного микроскопа - дорогого и сложного
прибора. Более того, многие возбудители морфологически
сходны, что снижает ценность этого метода. Наиболее часто
применяется
метод микроскопии
содержимого везикул
и
тканевых экстрактов, обработанных красителями (негативное
контрастирование), с последующим подсчётом ДНК- или РНК-
содержащих вирусов. Электронная микроскопия позволяет
быстро обнаружить орто- и парамиксовирусы в отделяемом
дыхательных путей, герпесвирусы в жидкости везикул и рота
вирусы в фекалиях.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ
Идентификация
вирусов
-
это
определение
принадлежности конкретного вируса, вызвавшего инфекционное
заболевание у пациента, не только к семейству и роду, но часто к
типу и даже подтипу. Тот факт, что большинству вирусных
инфекций сопутствуют развивающиеся в организме человека
иммунные реакции, является основой для вирусологической
диагностики.
Для
идентификации
вирусов
большее
распространение
получили
методы
вирусологической
диагностики,
основанные
на
выявлении
вирусов
с
99
использованием противовирусных антител. Часто специфические
сыворотки используют для идентификации вирусов в таких
диагностических тестах, как реакции нейтрализации.
Реакции
нейтрализации
цитопатического
действия
вируса
основаны на подавлении цитопатического эффекта,
вызываемого вирусом, при смешивании материала, содержащего
вирус со специфичными к нему антителами, которые содержат
стандартные
диагностические
сыворотки.
Для
постановки
реакции
неизвестный
вирус
смешивают
с
известными
коммерческими антисыворотками и после соответствующей
инкубации вносят в монослой клеток.
Отсутствие гибели клеток
указывает на несоответствие инфекционного агента и известных
АТ.
Для идентификации возбудителя, способного подавлять
цитопатическое действие известного цитопатогенного вируса при
одновременном заражении обоими вирусами культуры чув
ствительных клеток (это явление называют интерференцией с
цитопатогенным вирусом) используют в реакциях
торможения
цитопатического эффекта за счёт интерференции вирусов.
Для постановки реакции в культуру, содержащую изучаемый
вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу
краснухи при подозрении на это заболевание), инкубируют и
заражают вторую культуру; через 1-2 дня в неё вносят известный
цитопатогенный вирус (например, любой ЕСНО-вирус). При
наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что
первая культура бьша заражена вирусом, соответствовавшим
применённым антителам.
Вариантами реакции нейтрализации являются описанная
выше реакция торможения гемагглютинации (РТГА), а также
реакция торможения гемадсорбции
(РТГадс). В РТГА и РТГадс
выявляют специфические антитела, синтезируемые в организме
человека в ответ на внедрение вируса, и подавляющие
способность
вируса
агглютинировать
эритроциты
(гемагглютинацию), либо гемадсорбцию: у заражённых вирусом
культур клеток теряется способность адсорбировать на своей
поверхности
эритроциты.
С
использованием
способности
специфической
сыворотки
нейтрализовать
патологическое
действие вируса на куриный эмбрион либо лабораторное
100
животное
можно
ставить
регисции
нейтрализации
с
использованием живых организмов для выявления вирус—
нейтрализующих антител в сыворотке пациента.
Реакция иммунофлюоресценции
получила наибольшее
распространение (в частности, прямая РИФ) в диагностике
вирусных
инфекций
как
наиболее
быстрая,
достаточно
чувствительная и дающая хорошо воспроизводимые результаты.
Например, для того, чтобы идентифицировать цитомегаловирус
(ЦМВ) по его цитопатическому действию на культуру клеток
требуется около 3 недель, а при использовании меченных
флюоресцирующим агентом моноклональных антител к ЦМВ
идентификацию можно провести за 24 часа. РИФ можно ставить
непосредственно в культуре клеток, заражённых вирусом, внося
меченые сыворотки в культуру, и, отмыв после инкубации
несвязавшиеся
антитела,
с
помощью
люминесцентного
микроскопа выявлять зараженные вирусом клетки по их
флюоресценции.
Иммуноэлектронная
микроскопия
(ИЭМ)
- метод,
который позволяет идентифицировать различные вирусы, в
отличие
от
метода
обычной
(неиммунной)
электронной
микроскопии, который используют только для индикации
(выявления) и изучения морфологии вирусов. Поскольку,
основываясь
только
на
морфологических
особенностях,
невозможно идентифицировать вирус (многие вирусы имеют
сходную морфологию, но принадлежат к абсолютно разным
семействам или даже подцарствам), для проведения ИЭМ
используют меченые специфические сыворотки. Например,
сыворотки
метят
белком
ферритином,
способным резко
увеличивать контрастность тех вирусных частиц, с которыми
специфически связались меченые антитела.
СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Серологический метод диагностики
является наиболее
простым
и
доступным.
Метод
основан
на
выявлении
противовирусных антител в сыворотке пациента. При проведении
серологической диагностики вирусных инфекций сьшоротка крови
исследуется, как минимум, дважды: сразу после появления
101
клинических признаков и через 2-3 недели. Этот метод называют
методом
исследования
парных
сывороток.
Повторение
серологического
исследования
позволяет
исключить
возможность ошибки, связанной с выявлением не вновь
синтезированных антител к вирусу, а антител, циркулирующих
после предшествующей инфекции, которая была вызвана тем же
вирусом. Повторное исследование сыворотки, полученной в
период реконвалесценции, указывает на факт наличия свежего
случая заболевания только в том случае, если титр антител с
момента взятия первой пробы сыворотки у пациента увеличился
не менее чем в 4 раза.
В серодиагностике вирусных инфекций
РСК
является
наиболее доступным и наиболее распространенным методом.
Реакция позволяет обнаружить специфические к конкретному
вирусу комплементсвязывающие IgM и IgG .
Серологические реакции с меткой,
РИФ
и
РИА -
иммуносорбционные
методы,
являются
наиболее
информативными в вирусологической диагностике и позволяют
не только обнаружить вирусспецифические антитела, но и
определить их титр. Применять эти методы можно и для
выявления
антигенов вирусов.
В настоящее время имеются
разнообразные коммерческие наборы для выявления антигенов
целого
ряда
возбудителей,
позволяющие
проводить
идентификацию буквально за 5-10 минут.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Метод гибридизации ДНК
- высокоспецифичный метод,
позволяющий идентифицировать геном вируса после его
гибридизации комплементарными молекулами ДНК. В качестве
маркера для детекции обычно применяют изотопы. В методе
использована способность вирусной ДНК гибридизироваться
(связываться) с эталонной меченной (например, радиоактивным
изотопом) ДНК, которая является комплементарной к ДНК
вируса. Полученные таким образом гибридные двухцепочечные
молекулы ДНК (одна цепочка вирусная, вторая - эталонная
меченая) выявляют, регистрируя
их радиоактивность.
На
102
практике метод гибридизации нуклеиновых кислот in
situ
проводят следующим образом: эталонную меченую ДНК,
комплементарную к ДНК идентифицируемого вируса, наносят на
биоптаты инфицированных тканей и регистрируют взаимодей
ствие с вирусной ДНК. Метод применяют для выявления вирусов
простого герпеса, папилломы человека и др.
Метод
полимеразной цепной реакции (ПЦР)
значительно
увеличивает чувствительность метода гибридизации, поскольку
помогает увеличить количество копий вирусной ДНК в
исследуемом
патологическом
материале,
полученном
от
больного, а также значительно сокращает время, затраченное на
получение результата, необходимого для постановки диагноза.
Занятие № 30
ОРТОМИКСОВИРУСЫ.ПАРАМИКСОВИРУСЫ.
КОРОНАВИРУСЫ. ВИРУС КРАСНУХИ
Вирусологическая диагностика гриппа, парагриппа,
эпидемического паротита, кори, краснухи
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Учёт реакции непрямой гемагглютинации (повторение навыка
для его закрепления).
2. Учёт реакции гемагглютинации (повторение навыка для его
закрепления).
3. Учёт реакции торможения гемагглютинации (повторение
навыка для его закрепления).
4. Постановка
и
учёт
реакции
связывания
комплемента
(повторение навыка для его закрепления).
5. Иммунопрепараты (повторение навыка для его закрепления).
Основные методы диагностики гриппа
- вирусологичес
кие и серологические. Применяют также экспресс-диагностику, в
этом случае используют РИФ и ИФА для выявления антигенов
вируса в мазках-отпечатках со слизистой носа или смывов
носоглотки.
Вирусологическая диагностика предполагает вьщеление
возбудителя
путем
заражения
10-11-суточных
куриных
103
эмбрионов (либо клеточных культур). При накоплении вируса
ф иппа
в
культуре
клеток
проявляется
феномен
гемагглютинации. Тип вируса (А, В или С) определяют в РСК;
подтип гемагглютинина (Н) - в РТГА, а подтип нейраминидазы
(N) - в реакции ингибирования ее активности.
Серодиагностика используется для выявления титра антител
к вирусу в сыворотке пациентов с помощью РТГА, РСК, PH,
ИФА в парных сыворотках. Повторные реакции ставят с
интервалом 8-14 суток. Подтверждением диагноза является
четырёхкратный рост титра антител при сравнении образцов
сыворотки, полученной в острый период развития инфекции и в
период реконвалесценции (спустя 2-3 недели с момента начала
заболевания).
Вирусы
парагриппа
плохо растут на куриных эмбрионах,
поэтому их выделение осуществляют путем заражения культур
клеток почек эмбриона человека или обезьян. Индикацию вируса
проводят
по
цитопатическому
эффекту
и
феномену
гемадсорбции, а идентификацию - в РТГА или реакции
нейтрализации цитопатического действия, смешивая материал,
содержащий вирус парагриппа, со специфическими антителами к
нему. Серодиагностику проводят, регистрируя нарастание титра
антител в сыворотке пациента в РТГА.
Диагностика паротита
проводится преимущественно с
привлечением вирусологических и серологических методов.
Патологическим
материалом
для
микробиологической
диагностики являются: слюна, пунктаты околоушных желёз,
СМЖ и моча. Для вьщеления возбудителя заражают 7-8-
суточных
куриных
эмбрионов
либо
культуру
клеток
фибробластов кур. Идентификацию вируса эпидемического
паротита осуществляют с применением РТГА, PH, РСК или РИФ.
Серодиагностику проводят в РСК или РТГА, используя парные
сыворотки.
Экспресс-диагностика
включает
РИФ
для
быстрого
выявления
вирусных
антигенов
непосредственно
в
патологическом материале (в эпителии носоглотки) либо
микроскопию препаратов эпителия и выявление в мазках
гигантских многоядерных клеток.
104
чйП
■Ш
В
диагностике
инфекций,
вызванных
респираторно
синцитиальным
вирусом
(РСВ),
используются
вирусоскопические, вирусологические и серологические методы.
Патологическим материалом для вирусологических исследований
служат слизь из зева, отделяемое из носа и кровь. Вьщеляют РСВ
путем заражения культур клеток (например, Нер-2, HeLa) с
последующей идентификацией в РИФ, РСК и PH (ингибируя
образование синцития вирус-специфическими антителами). Для
экспресс-диагностики используют РИФ и ИФА, для выявления
вирусных
антигенов
в ж патологическом
материале.
Специфические
антитела к if вирусу вьывляю тэ в
парных
сыворотках с применением РСК и PH.
Экспресс-диагностика
к о р и
' основываетсй на выявлении
специфических ^ антигенов
вируса в " пораженных
клетках
(например, элейентахюсыпй) путем постановки РИФ. Для
вьщеления вируса используют культуру клеток. Индикацию
проводят по ЦПД и РА, а идентификацию в РТГА, а также в
реакции нейтрализации цитопатического действия вируса в
культуре
клеток.
Серодиагностика
обычно
проводится
с
применением РСК.
В диагностике
краснухи
также используется культура клеток,
вирус идентифицируют в РТГА, а также в тесте интерференции.
Серодиагностику применяют для выявления специфических к
вирусу IgM и IgG в РИФ, ИФА, а также в тесте радиального
гемолиза в геле. Применение ПЦР позволяет выявить в крови гены,
кодирующие синтез рецепторного белка вируса
Занятие № 31
РЕТРОВИРУСЫ
Вирусологическая диагностика ВИЧ-инфекции (СПИДа)
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Расшифровка показателей иммунограммы (повторение навыка
для его закрепления).
2. Учёт
реакции
иммунофенотипирования
лимфоцитов
(повторение навыка для его закрепления).
3. Иммунопрепараты (повторение навыка для его закрепления).
105
)
Поскольку развитие иммунодефицита является одним из
симптомов прогрессирующей инфекции, вызванной вирусом
иммунодефицита
человека,
важным
этапом
обследования
является составление иммунограммы пациента и ее анализ (или
расшифровка). Прежде всего, вирус поражает Т-лимфоциты (Т-
хелперы), поэтому особое внимание уделяется оценке их
количества и функциональной активности, например, в реакциях
розеткообразования.
Основным методом диагностики ВИ Ч-инфекции является
ИФА. Для постановки этой цели существуют различные тест-
системы, позволяющие выявлять в сыворотке пациента антитела
к вирусу. Однако при постановке ИФА возможно получение
ложноположительных
результатов,
поскольку
антигенная
структура гликопротеинов 120 - шипов, находящихся на
поверхности суперкапсида ВИЧ - имеет сходство со структурой
рецепторов, расположенных на клетках человека и участвующих
в транспорте Ig через эпителиальные клетки слизистых оболочек.
В связи с возможностью ошибки все положительно реагирующие
в ИФА сыворотки дополнительно тестируют на наличие вирус-
специфических антител, применяя иммуноблоттинг.
Культивировать
ВИЧ
достаточно
сложно,
поскольку
необходимы специальные клоны лимфоцитов для получения
культуры клеток. Чаще всего этот метод применяется не для
диагностики, а в научных целях, а также для получения вирусных
антигенов, необходимых компонентов, входящих в набор
диагностических тест-систем.
Занятие № 32
ПИКОРНАВИРУСЫ
Вирусологическая диагностика полиомиелита, острого
заразного насморка
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Учёт реакции непрямой гемагглютинации (повторение навыка
для его закрепления).
2. Учёт реакции гемагглютинации (повторение навыка для его
закрепления).
106
3. Учёт реакции торможения гемагглютинации (повторение
навыка для его закрепления).
4. Постановка
и
учёт
реакции
связывания
комплемента
(повторение навыка для его закрепления).
5. Иммунопрепараты (повторение навыка для его закрепления).
В диагностике энтеровирусных инфекций: полиомиелита,
инфекций, которые вызывают ЕСНО-вирусы и вирусы Коксаки
В,
чаще
всего
используются
культуры
клеток.
Для
идентификации вирусов Коксаки А заражают вирус-содержащим
материалом
новорожденных
мышей
(мышей-сосунков).
Идентификацию вирусов проводят в PH, РТГА и РСК.
Микроскопия интактных и пораженных вирусом полиомиелита
однослойных клеточных культур
Исследуют культуру ткани, выращенную в пробирках и
зараженную исследуемым материалом, содержащим вирус
полиомиелита. Репродуцирующийся в клетках вирус вызывает
дегенарацию
клеток
(результат
цитопатического
действия
вируса).
Дегенерация
клеточного
монослоя
определяется
при
микроскопировании (на малом увеличении, используют объектив
4х). Пробирку с культурой клеток помещают на специальную
подставку, затем - на предметный столик микроскопа. Степень
дегенерации монослоя обозначают:
± или + при незначительном количестве пораженных вирусом клеток,
++ при деганеративном гюражении 50% клеток,
+++ при 75% пораженных кдеток,
и м при полном разрушении монослоя.
Занятие № 33
ЭКОЛОГИЧЕС1САЯ ГРУППА АРБО - И РОБОВИРУСОВ.
РАБДОВИРУСЫ. РЕОВИРУСЫ
Вирусологическая диагностика клещевого энцефалита,
ротавирусных гастроэнтеритов, бешенства
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Учёт реакции непрямой гемагглютинации (повторение навыка
107