ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 30.10.2019
Просмотров: 3969
Скачиваний: 33
7. На приготовленный и окрашенный мазок нанесите каплю
иммерсионного масла и поместите препарат на предметный
столик микроскопа.
8. Окрашенные
препараты
рассматривают
тол ько
с
иммерсионными
объективом
(О И
90х
в
микроскопе,
работающем от внешнего источника света). В электрическом
микроскопе иммерсионный объектив обозначен как oil ЮОх.
9. Необходимо повернуть револьвер микроскопа до отметки
иммерсионного
объектива
и
после
легкого
щелчка
зафиксировать объектив в правильной позиции.
10. Поворачивая макрометрический винт, осторожно опускайте
тубус микроскопа до погружения объектива в иммерсионное
масло.
И . Наблюдая в окуляр, и медленно отдаляя объектив от
препарата,
установите ориентировочную
фокусировку
с
помощью макрометрического винта (найдите препарат в поле
зрения).
12. Выполните
окончательную
фокусировку
препарата
микрометрическим винтом, вращая его в пределах только
одного оборота: получите четкое изображение препарата.
13. Нельзя допускать резкого соприкосновения объектива с
препаратом, поскольку это может привести к поломке
препарата или фронтальной линзы.
14. Для того, чтобы быстрее найти препарат в поле зрения, во
время микроскопирования медленно перемещайте препарат
влево - вправо и вперед - назад (в электрическом микроскопе
для этой цели в предметном столике установлены специальные
винты).
О кончание работы (м икроскопирования)
1. Приподнимите тубус, снимите препарат.
2. При работе с электрическим
микроскопом
выключите
встроенную в микроскоп лампу.
3. Удалите масло с иммерсионного объектива чистой мягкой
салфеткой (тканью).
4. Переведите револьвер на малый (сухой) объектив 8х.
5. Протрите предметный столик микроскопа.
6. Опустите конденсор в максимально нижнюю позицию (при
работе с электрическим микроскопом этот этап отсутствует).
7. Установите предметный столик в максимально нижней позиции.
8. Поместите микроскоп в шкаф.
Метод бактериоскопического исследования имеет особое
значение
в
микробиологической
диагностике,
если
микроорганизм обладает морфологическими и тинкториальными
особенностями или имеет особую локализацию в клетках и
тканях макроорганизма.
Тем не менее, только при некоторых: инфекциях для
постановки диагноза достаточно изучения морфологических
признаков возбудителя. Следует помнить, что для диагностики
большинства инфекций микроскопия является первым этапом
микробиологического исследования и обычно имеет лишь
вспомогательное, ориентировочное значение.
В микробиологических лабораториях часто применяются
методы оптической микроскопии в проходящем свете. Световой
микроскоп имеет сухой и иммерсионный объективы. Причем
сухой объектив с относительно большим фокусным расстоянием
и слабым увеличением обычно применяют для изучения
относительно
крупных
биологических
и
гистологических
объектов. При изучении микроорганизмов используют главным
образом иммерсионный («пофужной») объектив с небольшим
фокусным
расстоянием
и
более
высокой
разрешающей
способностью
(увеличение
60ж-100х).
При
иммерсионной
микроскопии
объектив
погружают
в
масло
(кедровое,
персиковое, «иммерсиол» и др.), показатель преломления
которого близок к показателю преломления стекла. В этом случае
лучи света, пройдя через предметное стекло, не меняют своего
направления и не рассеиваются, а попадают непосредственно в
объектив (рис. 2, б). Разрешающая способность иммерсионного
объектива около 0,2 мкм.
Рис. 2. Ход лучей в сухой (а) и иммерсионной (б) системах
9
Общее увеличение микроскопа равняется произведению
увеличения объектива на увеличение окуляра. Например,
иммерсионный объектив с увеличением 100 х и окуляром 10х
дает увеличение объекта в 1000 раз.
Конденсор состоит из системы линз, предназначенных для
собирания лучей, идущих от зеркала (или встроенной лампы), в
одной точке - фокусе, который должен находиться в плоскости
рассматриваемого препарата. При микроскопировании с дневным
светом конденсор должен быть поднят до уровня предметного
столика. При изучении неокрашенных объектов следует опускать
конденсор.
Рис.З.
Принцип микроскопии с использованием
иммерсионной системы
Занятие № 2
МОРФОЛОГИЯ и УЛЬТРАСТРУКТУРА
БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ
Окраска по
Г
раму
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Окраска мазка по Г раму.
2. Идентификация по мазку стафилококка.
10
3. Идентификация по мазку стрептококка.
4. Идентификация по мазку палочковидной бактерии.
Алгоритм окраски мазка по Граму
1. Фиксированный мазок, приготовленный из смеси культур
стафилококка и кишечной палочки, покрывают полоской
фильтровальной бумаги, заранее пропитанной раствором
генцианового фиолетового и высушенной.
2. На бумагу наносят 2-3 капли воды так, чтобы бумага хорошо
пропиталась красителем и плотно прилегала к поверхности
предметного стекла.
3.Вьщерживают 2 минуты, снимают фильтровальную бумагу и
сливают остатки красителя в кювету.
4. Обрабатьшают мазок раствором Люголя в течение 1 минуты и,
не промывая его водой, сливают раствор.
5. Обесцвечивают мазок 95% спиртом: наносят на него несколько
капель спирта, берут препарат в руку и, слегка покачивая
стекло вверх-вниз, дожидаются момента исчезновения серо
фиолетовых струек красителя (в течение 20 секунд).
6. Быстро и тщательно промывают препарат водой.
7. Наливают на мазок фуксин Пфейффера, через 1-2 минуты
краситель сливают.
8. Промывают препарат водой.
9. Высушивают
препарат
фильтровальной
бумагой
и
микроскопируют с иммерсионной системой.
Г рамположительные
микроорганизмы
окрашиваются
в
фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный.
Идентификация по мазку стафилококка
и стрептококка
При микроскопии мазков стрептококка или стафилококка,
окрашенных
по
Граму,
нужно
помнить,
что
эти
грамположительные
бактерии
окрашены
в
синий
цвет.
Стафилококки будут образовывать в мазке беспорядочные груды
кокков правильной сферической формы, напоминающие гроздья
винограда. Стрептококки представлены овальными кокками,
расположенными в мазке цепочками.
11
Рис.4. Расположение в мазке стафилококка (а) и стрептококка (б)
Идентификация по мазку палочковидной бактерии
Рис.5. Микрофотография палочковидной бактерии
Грамотрицательные
микроорганизмы
палочковидной
формы,
например,
бактерии
кишечной
палочки,
будут
окрашиваться в красный цвет, иметь правильную палочковидную
форму, средние или мелкие размеры и располагаться в мазке
бепорядочно.
Сложные методы окраски
Сложные
методы
окраски
обычно
выполняются
с
использованием нескольких красителей, что дает возможность
дифференцировать одни микроорганизмы от других, а также
изучать
особенности
строения
микробных
клеток.
При
использовании окраски по методу Грама все бактерии можно
разделить на две большие группы - грамположительные и
грамотрицательные,
что
облегчает
проведение
12
микробиологической диагностики инфекционных заболеваний и
важно для выбора средств антимикробной терапии.
Грамположительные бактерии и дрожжи после окрашивания
клеточной стенки генцианвиолетом и прочного связывания
красителя, как следствие образования стойкого химического
комплекса в присутствии раствора Люголя, не обесцвечиваются
этанолом, сохраняя сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные —
обесцвечиваются
(вследствие
низкого
содержания
пептидогликана, высокого содержания липидов и отсутствия
тейхоевых кислот в клеточной стенке) и приобретают красную
окраску после докрашивания их водным фуксином.
Занятие № 3
МОРФОЛОГИЯ
и
УЛЬТРАСТРУКТУРА
БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ (ПРОДОЛЖЕНИЕ).
ОСОБЕННОСТИ МОРФОЛОГИИ АКТИНОМИЦЕТОВ,
СПИРОХЕТ, РИККЕТСИЙ, ХЛАМИДИЙ, МИКОПЛАЗМ
Окраска по Цилю-Нильсену
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Окраска мазка по Цилю-Нильсену.
2. Идентификация по мазку бацилл.
3. Идентификация по мазку капсульных бактерий.
4. Идентификация по мазку стрептомицетов.
5. Идентификация
по
мазку
плесневой
формы
микроскопического грибка.
6. Идентификация по мазку дрожжей и дрожжеподобных
грибков.
Алгоритм окраски мазка по Цилю-Нильсену
1. На фиксированный мазок поместите сухую чистую полоску
фильтровальной бумаги.
2. Нанесите на бумагу 3-4 капли карболового фуксина Циля.
3. Удерживая предметное стекло рукой за один из концов,
нагрейте препарат над пламенем спиртовки до появления
пара (повторите эту процедуру 3 раза).
13
4. После охл£
1
ждения стекла снимите фильтровальную бумагу
и промойте мазок водой.
5. Погрузите препарат аккуратно в 1% раствор серной кислоты
(для окраски спор) - три раза по 1 секунде.
6. Обильно промойте препарат водой.
7. Нанесите
на
мазок
2-3
капли
водного
раствора
метиленового синего на 3 минуты.
8. Промойте препарат водой. Просушите фильтровальной
бумагой.
Идентификация по мазку бацилл
Вегетативная клетка бацилл представляет собой крупную
палочку правильной формы с «обрубленными» концами и
окрашивается
по
Цилю-Нильсену
в синий
цвет,
споры
окрашивгшэтся в красный цвет. В мазке палочки бацилл
располагаются цепочками.
Рис. 6.
Бациллы - расположение в мазке цепочками:
а - вегетативная клетка, б - спора
Идентификация по мазку капсульных бактерий
При микроскопии капсульных бактерий в мазке (при
использовании
любого
метода
окраски)
вокруг
палочек
обнаруживается неокрашенный ореол, поскольку при окраске
методом контрастирования капсулы по Бурри - Гинсу, а также
при
использовании
любых
других
методов
капсула
не
окрашивается.
14
Рис. 7.
Капсульные бактерии: капсула имеет вид неокрашенного
ореола вокруг клетки
Идентификация по мазку стрептомицетов
При идентификации по мазку стрептомицетов нужно
помнить, что эти бактерии являются длинными тонкими
палочками и проявляют склонность к ветвлению, поэтому в мазке
их расположение напоминает ветвящийся мицелий грибов.
Рис. 8.
Стрептомицеты - тонкие палочки,
склонные к ветвлению
Идентификация по мазку плесневой формы
микроскопического грибка
Плесневая форма микроскопического грибка в мазке
представлена четко выраженным мицелием и плодоносящими
структурами. Следует учесть, что для микроскопического
исследования предлагается неокрашенный препарат грибка и при
микроскопии следует использовать сухой объектив с малым
увеличением (8х)
без иммерсии.
15
Рис. 9.
Мукор - микроскопический грибок
(а - мицелий, б - спорангий, в - эндоспоры)
Идентификация по мазку дрожжей и
дрожжеподобных грибков
При идентификации по мазку дрожжей и дрожжеподобных
грибков необходимо найти крупные по размеру, овальной формы,
почкующиеся клетки дрожжей, окрашенные с применением
простых методов (метиленовым синим или водным фуксином).
Рис. 10.
Овальные почкующиеся клетки дрожжей
Занятие № 4
ФИЗИОЛОГИЯ ПРОКАРИОТ
Окраска по Нейссеру
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Окраска мазка по Нейссеру.
2. Идентификация по мазку коринебактерий.
16
Алгоритм окраски по Нейссеру
1. На фиксированный мазок нанесите 2-3 капли ацетата
метиленового синего Нейссера. Окрашивайте от 1 до 2
минут. Слейте краситель (можно промьггь водой).
2. Нанесите на мазок раствор Люголя и оставьте на 30-60
секунд. Слейте краситель.
3. Промойте препарат водой.
4. Для докрашивания на мазок нанесите раствор везувина на
2-3 минуты.
5. Промойте препарат водой. Просушите фильтровальной
бумагой.
Зерна
волютина окрашиваются
в
темно-синий
цвет
(выглядят
коричневыми
на
фоне
желтой
цитоплазмы).
Цитоплазма бактерий окрашивается в желтый цвет.
Идентификация по мазку коринебактерий
В
мазке,
окрашенном
по Нейссеру,
коринебактерии
обнаруживаются в виде тонких палочек желтого цвета с темно-
коричневыми гранулами на концах, которые располагаются под
углом друг к другу, образуя комбинации, напоминающие буквы
X, Y и V.
^
3
-
\
б
Г
1
Рис.11.
Коринебактерии: в мазке видны вегетативные клетки (а)
и зерна волютина (б).
• >2
6
7
-
12
6
-
-
а д у к а ц ы ! « Г р о д зе н с к !
Б1БЛЮТЭКА
1Я0ННПН1Г8М
®
Зз
со
я