ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 30.10.2019
Просмотров: 3972
Скачиваний: 33
I
locKOJibKy выделение возбудителя при ми^qx)биoлoгичecкoй
диш-носгике сифилиса обычно не проводят, основой диагностики
являются серологические методы, направленные на выявление
антител в сыворотке пациента. При этом
одним из ведущих
методов является РСК,
предложенная А. Вассерманном.
Применяются также: реакция микропреципитации (РМП) - в
качестве скринингового теста, реакция иммобилизации и др. Все
серологические
тесты
делят
на
неспецифические
и
специфические.
Неспецифические тесты проводят без участия трепонем с
использованием
кардиолипинового
(нетрепонематозного)
антигена,
поскольку при развитии заболевания (со 2-й - 4-й
недели) обравуются неспецифические антитела реагинового типа,
способные связываться с липоидными экстрактами из мышцы
бычьего сердца (кардиолипиновым антигеном), так называемые
вассермановские антитела.
Их выявляют в РСК, и РМП (метод
экспресс-диагностики). При постановке РМП с целью выявления
антител - реагинов плазмы, ставится реакция преципитации на
стекле с использованием в качестве антигена частиц угля
нагруженных кардиолипином.
Из специфических тестов, в которых используют антигены,
приготовленные из культур трепонем сифилиса, наиболее
значимой является реакция иммобилизации бледной спирохеты:
специфические антитела пациента иммобилиз}тот бактерии и
обусловливают потерю ею подвижности. Непосредственно с
трепонематозными антигенами (т.е. с антигенами возбудителя) можно
ставить РМП.
Следует помнить, что проведение специфических тестов
допустимо
только
в
специализированных
лабораториях,
приспособленных
для
работы
с
высоко
патогенными
возбудителями.
Для^ ранней диагностики
можно
применять реакции
непрямой иммунофлюоресценции для выявления антигенов
возбудителя в патологическом материале с использованием
флюоресцирующей адсорбированной сыворотки, либо ПЦР
(метод позволяет выявить ДНК возбудителя сифилиса в соскобах
со слизистых уретры, цервикального канала, а также в крови).
88
Диагностика лептоспироза основана, прежде всего, на
бактериоскопическом методе; выявлении подвижных живых
лептоспир в темном поле. Готовят препарат «раздавленная
капля» и микроскопируют с сухой системой (объектив 40х) в
темном поле: серебристо-белые лептоспиры имеют вид тонких
длинных палочек с крючьями на концах, которые активно
передвигаются. Серологическую диагностику - определение
титра
антител
-
можно
проводить
в
реакциях
микроагглютинации-лизиса
(РМАЛ).
Для
этого
в
лунки
полистиролового
планшета
вносят
разведения
сыворотки
пациента, затем в каждую лунку добавляют культуру живых
лептоспир. Реакция регистрируется по феномену агглютинации -
набуханию и склеивании отдельных лептоспир в скопления,
напоминающие «паучков» (рис.32).
Рис.32.
Реакция микроагглютинации-лизиса - скопления
лептоспир в виде «паучков»
Титром реакции считается та концентрация антител в
сыворотке, которая вызвала образование «паучков». РМАЛ
можно ставить и как ориентировочную - на стекле. Титр антител
можно также определять в ИФА или РСК с применением парных
сывороток.
Реакция связывания комплемента используется также и в
серологической диагностике
эпидемического
и
эндемического
сыпного тифа. В
качестве антигена для выявления в сыворотках
89
больных специфических антител к возбудителю используются
препараты, содержащие антигены риккетсий Провачека или
риккетсий эндемического тифа.
Занятие № 27
ПАТОГЕННЫЕ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ГРИБЫ И
ПРОСТЕЙШИЕ
Микробиологическая диагностика микозон и инвазий
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Идентификация
по
мазку
плесменой
формы
микроскопического грибка (повторение памыка для его
закрепления).
2. Идентификация по мазку дрожжей и дрожжеподобных
грибков (повторение навыка для его закрепления).
3. Иммунопрепараты (повторение навыка для его закрепления).
Микробиологическая диагностика микозо»
и
инвазий
включает практически все методы, известные в настоящее время,
однако в каждом отдельном случае предпочтение отдается каким-
то определенным диагностическим подходам.
Наибольшее
распространение
получили
методы
микроскопических
исследований патологического материала для ныяплсиия в нем
возбудителя. При микозах микроскопируют мазки как нативные,
так и фиксированные и окрашенные с применением простых и
сложных методов окраски. Основанием для постанонкн диагноза
при аспергиллезе считают обнаружение в бионтатах и мокроте
мицелия и характерных конидиеносцев, несущих конидии,
строение которых обусловило название грибов (лат^
uspcrgillus,
лейка). При кератомикозах материалом для микроскопического
исследования служит пораженная кожа, при каидидозах -
соскобы слизистых и кожи. Пневмоцисты обычно ()кр;пиинают по
Романовскому-Гимзе: в мазках из мокроты и
c jh i
чи ныявляют
цисты, имеющие форму розетки.
В препаратах, приготовленных с использошипи-м свежего
(еще теплого) кала, можно выявить подвижные штстативные
формы амебы - трофозоиты. Криптоспоридии ныннляют в
90
испражнениях, фиксируя и окрашивая мазки по Цилю-Нильсену.
Ооцисты возбудителя окрашиваются в красный или розовый цвет
и
легко
обнаруживаются
на
сине-фиолетовом
фоне.
Трихомонады также
изучают в
нативных
препаратах:
с
применением фазово-контрастной микроскопии либо путем
окраски мазков (из соскобов со слизистых наружных нoJЮвыx
органов)
по
Романовскому-Гимзе.
При
малярии
основу
диагностики составляет микроскопия препаратов крови (капли и
мазка), которая помогает выявить паразит в крови. Для экспресс-
диагностики проводят микроскопию крови в толстой капле
(препараты окрашивают без фиксации).
Из
современных
методов диагностики
грибковых
и
паразитарных инфекций все чаще применяют ИФА как для
выявления антигенов возбудителя в патологическом материале,
так и для определения титра специфических антител в сыворотке
пациента, и ПЦР. Тем не менее, часто и в настоящее время
«золотым
стандартом»
диагностики
по-прежнему остается
культуральный метод: выделение чистой культуры возбудителя
из патологического материала.
ИТОГОВОЕ ЗАНЯТИЕ ПО МЕДИЦИНСКОЙ
БАКТЕРИОЛОГИИ С ОСНОВАМИ МИКОЛОГИИ И
ПРОТОЗООЛОГИИ
Перечень практических навыков по медицинской
микробиологии с основами микологии и протозоологии
1. Выявление в мазке из уретрального гноя гонококка или в мазке
из осадка ликвора - менингококка.
2. Алгоритм проведения и учёт фаготипирования бактериальной
культуры.
3. Дифференциация лактозопозитивных и лактозонегативных
колоний на дифференциально-диагностических средах (Эндо,
Левина, Плоскирева).
4. Засев скошенного агара по Щукевичу.
5. Обнаружение в мазках из мокроты, окрашенных по Цилю-
Нильсену, микобактерий.
6. Идентификация клостридий по мазку.
91
В И Р У С О Л О Г И Я
Занятие № 29
ОБЩАЯ ВИРУСОЛОГИЯ
Методы вирусологических исследований
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Учёт реакции непрямой гемагглютинации.
2. Учёт реакции гемагглютинации.
3. Учёт реакции торможения гемагглютинации.
4. Иммунопрепараты (повторение навыка для его закрепления).
Сущность РНГА заключается в том, что эритроциты
обладают способностью связывать на своей мембране антигены,
в результате чего они становятся сенсибилизированными
(«чувствительными») к сыворотке, соответствующей связанному
антигену.
При
воздействии
специфических
антител
сенсибилизированные эритроциты склеиваются и выпадают в
осадок, образуя гемагглютинат (рис.33).
Рис.33.
Схема постановки реакции непрямой гемаи люч инации
Учёт реакции непрямой гемагглютинации
Для постановки РНГА использую: эр и тр о ц тм , вирусный
антиген и сыворотку пациента. Сначала эритроци ты смешивают с
антигеном в буферном растворе и инкубируют для их
сенсибилизации (либо используют уже готовые препараты
эритроцитов, «нагруженные» вирусным антигеиом). В лунках
планшета готовят серию разведений сыворотки пациента, в
92
каждую лунку вносят сенсибилизированные эритроциты
оставляют при комнатной температуре на 1 час (рис.34).
Patient
S
S 3
а
3
ее
5
2
i
1
T iter
1
•
•
•
•
•
•
%
•
Ф
64
2
•
•
•
« )
•
S
3
•
•
•
•
•
•
•
•
•
<§) •
512
4
■«>
%
% %
<*>
•
<•)
<2
S
•
•
•
•
•
% %
•
«
%
!«} •
•
•
•
•
•
Ф
1ZS
7
•
•
•
•
•
(«>
•
52
•
•
«> # )
СФ
•
4
Рис.34.
Схема постановки реакций гемагглютинации для
вычисления титра антител в сыворотках пациентов (8 проб):
слева - порядковый номер пациента, сверху ~ разведения
сывороток (от 1:2 до 1:1024, предпоследняя лунка-
положительный, последняя - отрицательный контроль),
справа - титр сыворотки каждого из пациентов
При положительной РНГА агглютинированные эритроциты
образуют осадок, покрывающий почти все дно лунки в виде
«зонтика», при отрицательной — на дне лунок образуется
компактный однородный осадок в виде «пуговки» (рис.35).
I
т
а
б
Рис. 35.
Учет реакции гемагглютинации (прямой и непрямой):
а - отрицательная реакция («пуговка»),
б - положительная реакция («зонтик»)
Реакции
непрямой
гемагглютинации
применяют
для
серодиагностики вирусных инфекций, например, заболеваний,
вызванных риновирусами, для выявления HBsAg вируса гепатита
В и антител к вирусу в сыворотке пациентов.
93
Многие нирусы способны агглютинировать эритроциты, в
гом
числе
орто-
и
парамиксовирусы.
Причем
реакции
гемагглютинации (РГА) можно специфически ингибировать,
применяя стандартные иммунные сыворотки или сыворотки
больных, содержащие антитела к вирусу. В присутствии
специфической сыворотки осуществляются реакции торможения
гемагглютинации (РТГА). РГА и РТГА применяют в диагностике
гриппа, парагриппа, кори, краснухи и многих других вирусных
инфекций.
Учёт реакции гемагглютинации
Для постановки РГА и РТГА берут суспензию (0.5% в
буфере) эритроцитов человека или барана. В качестве антигена
используют жидкость из аллантоисной полости
куриного
эмбриона, инфицированного вируссодержащим патологическим
материалом. Жидкость из аллантоисной полости куриного
эмбриона титруют (разводят в буфере, например, 1:8, 1:16 и т.д.)
и вносят в лунки планшета, туда же вносят суспензию
эритроцитов и помещают в термостат, через 30 минут учитывают
результат реакции. Положительной считается реакция в тех
лунках, где эритроциты дают на дне лунки неоднородный осадок
в виде перевернутого «зонтика». Отрицательный результат -
формирование на дне лунки компактного однородного осадка в
виде «пуговки». Положительная РГА свидетельствует лишь о
присутствии вируса в исследуемом материале, ее используют для
индикации
вируса.
Для
окончательной
идентификации
используют РТГ А.
Учёт реакции торможения гемагглютинации
Реакцию торможения гемагглютинации (Р'ГГА) также
ставят в планшетах, причем ее можно использовать не только для
идентификации
вируса,
выделенного
из
патологического
материала, но и для выявления титра антител к данному вирусу в
сыворотках пациентов.
Для идентификации вируса реакция ставится так же, как и
РГА, но в лунки, в которые добавлена взвесь эритроцитов и
вируссодержащий материал, дополнительно внося !' стандартные
специфические сыворотки. Реакция считается положительной в
94
тех лунках, где не происходит (тормозится) гемагглютинация, то
есть вместо «зонтика» образуется «пуговка».
Для выявления и подсчета титра антител в сыворотке
пациента сыворотка предварительно титруется: готовятся ряды ее
разведений
в
лунках
планшета
(в
порядке
возрастания
разведения), затем в лунки добавляют стандартную взвесь
эритроцитов
и
стандартный
препарат
соответствующего
вирусного антигена. Например, при диагностике гриппа в один
ряд лунок с разведениями сыворотки вносят антигены вируса
гриппа типа А, во второй - типа В и т.д. Планшеты инкубируют и
затем оценивают результат так же, как и при постановке РТГА
для идентификации вируса: если появляется «пуговка», реакция
положительная, а если «зонтик» -
отрицательная. Титром
сыворотки считают ее наибольшее разведение, которое вызывает
выраженное ингибирование гемагглютинации.
В качестве контролей РТГА, в которой идентифицируют
вирус, ставят реакцию со стандартными препаратами вирусных
антигенов, а при выявлении вирусоспецифических антител в
сыворотке
пациента
используют
стандартные
препараты
сывороток ( например, сывороток к вирусу гриппа типа А, типа В
и т.д.).
ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ
ИНФЕКЦИЙ
> Цитологические методы, включаюище экспресс-диагностику,
позволяющую выявить вирус по цитопатическим эффектам,
которые
вызывает
его
присутствие
в
клетках
макроорганизма. Например, выявление телец включений с
использованием
методов
микроскопии.
К
экспресс-
диагностике относят выявление вируса в исследуемом
патологическом материале с применением РИФ или ИФА.
> Вирусологические методы - выделение и идентификацию
вируса - возбудителя инфекции с использованием живой
метаболизирующей клетки.
> Серологические методы - выявление и вычисление титра
специфических противовирусных антител в сыворотке
крови пациента.
95
* М
1
)лскулирио-
1
снетические
методы,
которые
осуществляются с привлечением современных методов
молекулярной биологии, например, полимеразной цепной
реакции (ПЦР).
ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Многие вирусы вызывают появление в заражённых клетках
характерных образований,
телец включений,
- скоплений
отдельных вирусных белков или целых вирионов, видимых в
световой микроскоп.
Тельца включений
могут располагаться
как в цитоплазме (тельца Гварнери при оспе), так и в ядрах
клеток (аденовирусные инфекции).
РИФ
и
ИФА
часто используют для быстрой идентификации
вирусов и основаны на обнаружении вирусных антигенов с
использованием специфические сывороток.
Например, для
ранней диагностики ВИЧ-инфекции широко используют ИФА,
выявляющий поверхностные антигены вируса.
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
«Золотым стандартом» в диагностике вирусных инфекций
является
культивирование, выделение и идентификация
вирусов.
Поскольку вирусы размножаются только в живых
клетках,
выделение
возбудителя
возможно
лишь
с
использованием живой метаболизирующей системы: культуры
клеток, куриного эмбриона или лабораторного жиютного.
Культивирование, вьщеление и идентификация вирусов в
заражённой конкретным вирусом культуре клеток - один из
основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку
большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая
специфичность, то почти к каждому вирусу можно подобрать
соответствующие
клеточные
культуры,
а
также
создать
стандартные условия культивирования (наличие клеток одного
типа). В
качестве культуры клеток можно использовать
предварительно гомогенизированные и обработанные трипсином
органы и ткани. При помещении их на дно специального сосуда
для культивирования («матраца») клетки вырастают в виде
монослоя. Жизнеспособность таких культур, как правило, не
96
превышает
3
недель,
и
они
не
подлежат
повторному
культивированию, поэтому они получили название
первично-
триисинвзированные культуры.
Культуры,
пригодные к
повторному росту и способные сохранять жизнеспособность при
20-30
пересевах,
называют
иолуперевиваемыми.
Перевиваемые
линии
(культуры)
клеток
представлены
клетками,
которые
можно
длительно
культивировать
и
перевивать, поскольку они наиболее однородны по морфологии и
стабильны по свойствам. Часто для культивировании вирусов
используют эмбриональные ткани (человека и животных) либо
трансформированные опухолевые клетки.
Амниотическая
полость
Рис.36.
Схема строения куриного эмбриона
Куриные эмбрионы (рис. 36) - наиболее адаптированные
модели для культивирования таких вирусов, как вирус гриппа,
кори и др. Их можно использовать и для первичного вьщеления
вирусов из патологического материала, и для накопления вируса
в количествах, необходимых для окончательной идентификации
возбудителя. Заражение куриного эмбриона осуществляют на
хорион-аллантоисную
оболочку,
в
аллантоисную
либо
амниотическую полости, а также в желточный мешок.
Животные модели используют в случае невозможности
вьщелить и идентифицировать вирус стандартными методами. В
этом
случае
патологический
материал,
инфицированный
вирусом, вводят чувствительным к возбудителю животным.
97