ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 30.10.2019
Просмотров: 3983
Скачиваний: 33
генциановый фиолетовый, который подавляет рост гнилостной
микрофлоры. В среды также добавляют сульфит натрия в
качестве стимулятора роста чумной палочки, и орошают
антифаговой сывороткой для подавления размножения чумного
бактериофага. На плотных средах бактерии образуют R-колонии.
Причем, если изучать структуру колоний с помощью микроскопа,
можно выявить три стадии роста культуры. После 10-12 часов
культивирования под микроскопом видны «молодые» бесцветные
микроколонии с неровными краями («битое стекло»). Через 18-
24 часа микроколонии сливаются, формируя нежные плоские
колонии с фестончатыми краями и приподнятым желтоватым
центром («кружевные платочки»).
А после 40-48 часов
культивирования вырастают «взрослые» колонии - крупные, с
бурым зернистым центром и неровными краями («ромашки»).
Простым и надежным методом диагностики чумы являются
серологические реакции. Антигены чумной палочки можно
выявлять
в
РИГА
с
использованием
эритроцитарного
диагностикума
(эритроциты
барана,
нагруженные
моноклональными
антителами
к
капсульному
антигену
возбудителя), ИФА и др. С целью обнаружения антигенов
Y pestis в тканях погибших животных проводят реакцию
термопреципитации по Асколи.
Антитела в сыворотке крови
больных
выявляют
с
применением
реакций
непрямой
гемагглютинации (РИГА), ИФА и др. Для ретроспективной
диагностики ставиться также кожно-аллергическая проба с
пестином (белком, выделенным из культуры возбудителя).
Для
проведения
ускоренной
диагностики
можно
использовать
чумной бактериофаг.
Его высокая специфичность
и вирулентность для чумной палочки делает его полезным при
проведении идентификации чумы с применением метода слоев
по Грациа, метода стекающей капли. Можно также выявлять
увеличение титра бактериофага в исследуемом материале
(свидетельствует о положительном результате).
Для микробиологической диагностики
сибирской язвы
в
качестве патологического материала используют содержимое
пустулы, гнойное отделяемое из карбункула, кровь, мочу,
мокроту, испражнения и рвотные массы. При постмортальнои
диагностике
исследуют
кусочки
органов.
Кроме
78
■■и
1
. и'риоскопического
метода,
предполагающего
выявление
'-'И
1
И
1111
и мазке (см. выше), используются бактериологический и
■' |И
11
|П
1
ический методы диагностики. Бактерии выращивают на
• I (иироючном мясо-пептонном агаре, на котором обнаруживают
. ис к-колонии серовато-белого цвета с неровно очерченным
' |'.и м
При
изучении колоний
под
малым увеличением
|м|. |
1
П
1
копа
обнаруживается
их
неоднородная
структура,
мишмимающая
переплетающиеся,
спутанные
волосы
(это
• мм (.ПИ) с расположением бацилл в мазке в виде длинных
ипи'иидиых цепочек, расходящихся от центра), поэтому колонии
УШЛИ название «грива льва» или «голова медузы».
11(>лученную чистую культуру возбудителя используют для
11111
ыиоики
теста
«жемчужное
ожерелье».
Для
этого
в
•
1 1
т
1
|ни()чмый бульон
С
пенициллином (0.5 ЕД/мл) вносят
и |. цусмую культуру бацилл, инкубируют в течение 3 часов
и|и( !/" (' и затем готовят из культуры мазки, окрашивают
t. шмсиоиым синим и микроскопируют. Бациллы сибирской
..... . мыра
1
ценные в среде с пенициллином, образуют в мазке
Н.
1
И
1
ЧКИ, состоящие из шарообразных клеток, напоминающих
Иепатогенные бациллы, а также B.cereus сохраняют
и|м
1
куш.гимировании в среде с пенициллином палочковидную
■|И4|1М\
11|||| аишшзе трупов погибших животных, а также при
•i »(
1
ич ишемии
санитарного
надзора
перерабатываемого
..... ..
сырья, например меха и шкур в кожевенной
■
||'"М
1
.
1
т л с
1
М
1 0
сти,
применяется
реакция термопреципитации по
1
о '
1
и. Гс-рмостабильные антигены возбудителя сибирской язвы
. 1
.
1
||.м ирукп из исследуемого материала кипячением на водяной
'"ИИ пицучаю'г экстракт, содержащий термостабильный антиген,
и t.uiM Iш ияг реакцию кольцепреципитации с использованием
им.
имшммупной
специфической
преципитирующей
ш м циттм пю й сыворотки (содержит специфические антитела к
ми ИИ ним ночбудителя). Реакция термопреципитаций по Асколи
..... . НИИ иажна в тех случаях, когда из патологического
уже не удается выделить живой возбудитель и
>1
И
1
.ЫИ
.1
()акгериологических исследований (посевов на среды)
||>ии.
1
ич|ы
1
ы. В качестве контролей используют стандартный
•
и темный антиген - для
контроля преципитирующей
79
сыворотки,
а также сыворотку здорового человека
контроля антигена.
для
Занятие № 23
МИКОБАКТЕРИИ. АКТИНОМИЦЕТЫ. ЛИСТЕРИИ
Микробиологическая диагностика туберкулеза, проказы,
актиномикоза, листериоза
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Обнаружение в мазках из мокроты, окрашенных по Цилю-
Нильсену, микобактерий.
2. Идентификация по мазку стрептомицетов (повторение навыка
для его закрепления).
3. Иммунопрепараты (повторение навыка для его закрепления).
Обнаружение в мазках из мокроты, окрашенных
по Цилю-Нильсену, микобактерий
Препараты
для
идентификации
кислотоустойчивых
микобактерий готовят из гнойных частиц мокроты. По Цилю -
Нильсену возбудитель туберкулеза окрашивается в рубиново
красный цвет, все остальные элементы мокроты: клеточные
элементы, слизистое веш,ество мокроты (т.е., фон препарата) - в
голубовато-синий. Микобактерии имеют вид тонких, слегка
изогнутых палочек (рис.28) с утолш,ением на одном из концов -
«швейная
игла».
Располагаются
в
мазке
группами
или
поодиночке. Обнаружение микобактерий в мазке - достоверный
признак туберкулезного процесса в легких.
Кроме
изучения
мазка,
в
диагностике
туберкулеза
используются бактериологические исследования. В этом случае
проводят посевы мокроты на
среду Левенштейна - Йенсена.
Среда является селективной для микобактерий туберкулеза,
поскольку содержит малахитовый зеленый, подавляющий рост
контаминирующей патологический материал микрофлоры.
Для
стимулирования
роста
возбудителя
туберкулеза
добавляют картофельный крахмал и препарат, приготовленный
из куриных яиц.
80
Микобактерии в мазке из мокроты: тонкие слегка
изогнутые палочки
I'.ii i'yi' микобактерии очень медленно, наиболее часто
[П)ста отмечают на 2 0 ^ 0 -й день: появляются сухие
|м I |
11
и I I.IC колонии белого или слегка желтоватого цвета,
инипмиипкицие цветную капусту.
Vi hopcmibm
метод
бактериологической
диагностики
и. vMi.'i |ц)|ик)т,
выращивая
микрокультуры
микобактерий
<
(и.уипа
- метод Прайса.
Микроколонии получают на
м(м .(м.'шых стеклах, нанося на них в виде толстого мазка
•111
и '|усм
1
.
1
й материал, и погружая стекла в среду Прайса (кровь
смешанная с 5% цитратом натрия и разведенная
ttt. иишироианной водой). После 7-10 дней культивирования
■
" I п р о м ы в а ю т ,
окрашивают
по
Цилю-Нильсену
и
мм
1
.|м
1
. м птрую т.
Под
микроскопом
микрокультуры
1
српй туберкулеза располагаются в виде «жгутов» или
•
(|iiu'.2‘)).
1
'и
1
/') МIIкроколонии патогенных микобактерий, выращенных
МП I ICKJIC по методу Прайса (видны отдельные палочки
губеркулеза, формирующие «косу»)
81
Занятие № 2 4
а н а э р о б н ы е
б а к т к р и и
«
„ ™ к „ „„агностика а..а .р<Л..ой газовой
'""К'~®“ о " ; „ 7 “ . . и , « . л б н я к а , ботулизма
„ ,а ш п и .е с .и е « а ш ш . - р и о б р е ^
идентиф икация
Г ^ Г ой
гангрены
Вегетативные
клетки
^
варьировать от
представлены "“ ^ “
^ “ р т о л о ж и т е л ь н ы при окраске по
мелких до крупных.
окоаски не прокрашиваются и
Граму. Споры при этом
участков, овальной или
видны в мазке в виде
у клостридии
Д—
« « к !,-, в месте расположения споры образуете,
вздутие (утолщение).
Рис.30. Мазок, содержащий патогенные клостридии,
окрашенные по Граму
т т
_ Нильсену вегетативная часть клетки
о к р а ш Г Г Т е Т н Г н в ^ . а кислотоустойчивые споры - в
красный.
патологического материала
„р „ Г а г Г с ^ Г а ^ ^ н о » раневой иифекнни, характерно
отсутствие лейкоцитов.
82
У возбудителя газовой гангрены С. perfringens споры
крупные по размеру, овальные, могут быть расположены в клетке
центрально либо субтерминально. В мазках из патологического
материала только этот вид клостридий образует капсулу.
У возбудителя столбняка C .tetani споры круглые, обычно
расположены терминально. Их диаметр в 2-3 раза превышает
толщину вегетативной части клетки, вследствие чего в мазке они
напоминают по форме «барабанные палочки».
С.
botulinum - палочка с закруглёнными концами, в мазках
располагается поодиночке, иногда в виде коротких цепочек.
Эндоспоры - крупные, имеют овальную форму, расположены
чаще всего субтерминально, что придает палочке ботулизма
([)орму «теннисной ракетки».
Материалом для микробиологических исследований при
раневой анаэробной инфекции (газовая гангрена) служат кусочки
пораженных некрозом тканей, перевязочный и шовный материал
(при исследовании на обсемененность спорами патогенных
к^юстридий), образцы почвы. При ботулизме - испражнения и
продукты. Основным методом диагностики является выделение и
идентификация возбудителей, а также их токсинов.
Для выполнения процедуры выделения и идентификации
нозбудителей клостридиозов используют такие среды, как Китта-
Гирогщи (для накопления возбудителя), агар Цейсслера и среда
Нильсона-Блэра - для выделения чистой культуры. Выделять
чистую культуру С.
novyi
можно на агаре с бензидином,
поскольку колонии возбудителя, выращенные на этой среде,
(M.ic i po чернеют при попадании воздуха.
11ри засеве в среду Вильсона-Блэра С.
perfringens
уже после
I
'1
часов культивирования вызывает почернение столбика среды
(|И.р
1
пование
сульфида
железа
из
Маг8
и
FeC^),
1
ч||(ц»иождающееся появлением разрывов среды (обусловлено
и(.|
1
а юнанием СО
2
). Культура С.
perfringens
(особенно типа А)
•и IUCI характерный запах масляной кислоты. Эти бактерии
ипичниипо створаживают молоко с образованием губчатого
' I и
11
.
,1
и пены - феномен, известный как «ш торм овая
pi'oi. цни». На агаризованных средах возбудитель образует R-
• и и.ПИИ
неправильной
формы,
бугристые,
с
неровными
>.■< |м
1
ч п|тп,
1
ми краями. На агаре Цейсслера колонии окружены
83
г
зоной гемолиза. Рост колоний в глубине столбиков агара
напоминает комочки ваты, а при засеве материалом, содержащим
возбудитель, на среду Китта-Тароцци уже через 1-2 часа могут
появляться помутнение и пузырьки газа, которые всплывают из-
под кусочков паренхиматозных органов, нахо;
1
ящихся на дне
пробирок с посевами, при встряхивании.
Для выявления и идентификации типа токсина используют
реакцию преципитации в геле и реакции нейтрализации токсина
специфическими
антитоксическими сыворотками.
Особенно
важно выявить тип токсина при ботулизме.
Посев патологического материала на среду К ип а-Гароцци
1. Для посева используют пробирки со средой Ки гга-Тароцци,
предварительно прокипяченной и быстро остуженной до
40°С, на поверхность которой наносится гопкий слой
стерильного вазелинового масла.
2. Стерильной пастеровской пипеткой с том ко очтянутым
капилляром
делается
забор
неболыпо1Ч)
количества
патологического материала и посев на самое дно пробирки,
через слой вазелинового масла.
3. Пробирки плотно закрывают пробками и
1
к
1
ра(|)и
11
ируют.
Затем помещают в термостат для культивироиапня.
Занятие № 25
К О РИ Н Е БА К Т Е РИ И . Б О РД ЕТЕЛ Л Ы . П Л Ч О Ф И Л Ы .
Л Е Г И О Н Е Л Л Ы
М икробиологическая диагностика дифте|>ии, коклю ш а,
заболеваний, вы зы ваем ы х гемофилами, Jiei нопслл1‘зив
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Идентификация по мазку коринебактерий (иоигоргиис навыка
для его закрепления).
2. Иммунопрепараты (повторение навыка для его чмкрсмлсния).
И дентиф икация по м азку кориш-Лакк-рнй
В мазке коринебактерии обнаруживаю! и ипдс ю пких, в
основном прямых палочек, которые утолщены на концах.
Обычно микроскопируют мазки, окрашенные по Леффлеру (с
применением щелочной метиленовой синьки Леффлера), либо по
Нейссеру. По Леффлеру палочки окрашиваются в бледно-
голубой цвет, а зерна валютина - в тёмно-синий, по Нейссеру
зёрна валютина вьп'лядят тёмно-коричневыми на фоне желтой
цитоплазмы. В мазках палочки С.
diphtheriae
располагаются в
виде латинских букв V, Y, L или X, а образовавшиеся «вздутия»
на концах палочки в местах расположения гранул валютина
придают ей форму булавы. Отсюда и название семейства и рода:
от греческого слова
согупе,
булава.
Для
культи ви р о ван и я
коринебактерий
чаще
всего
используют кровяные среды с теллуритом калия или натрия -
среды Клауберга. Поскольку дифтерийная палочка устойчива к
высоким концентрациям теллурита, добавление его в среду
ингибирует рост сопутствующей микрофлоры и создает для
возбудителя
селективные
условия.
При
выращивании
коринебактерий на среде Клауберга возбудитель образует
серовато-чёрные колонии. Черная окраска обусловлена тем, что
при росте на среде происходит восстановление теллурита до
металлического теллура и накопление металла в бактериальной
клетке.
Следует помнить, что при диагностике дифтерии очень
важным является тест на выявление продукции возбудителем
дифтерийного экзотоксина (нетоксигенный штамм не способен
вызывать дифтерию). Для этих целей используется реакция
иммунодиффузии в геле по Оухтерлони. При постановке реакции
используют агаризованную среду с пониженным содержанием
Fe
, чтобы вызвать интенсивное токсинообразование. На центр
застывшего в чашке Петри агара накладывают полоску
фильтровальной
бумаги,
пропитанной
антитоксической
сывороткой, и по обе стороны от этой полоски высевают
вьщеленную из патологического материала чистую культуру
возбудителя и два контрольных штамма, токсигенного и
нетоксигенного. В результате встречной диффузии токсина и
антитоксина в месте их контакта появляются дуги («усы»)
преципитации.
84
85
I I
dcci
) тампоном слизи из зева на среду Ру
I Магсриал отбирают стерильными ватными тампонами,
сухими или смоченными (до стерилизации!) 5% раствором
глицерина.
2. При заборе материала (берется только фибринозная пленка)
при этом стараются не касаться ротовой полости и глотки
(рис. 31).
3. Делается засев тампоном на среду Ру.
4. Пробирки с посевами помещают в термостат.
Рис.31. Техника забора патологического материала и посева на
среду Ру при дифтерии зева.
Если
материал
нужно
транспортировать,
тампоны
помещают в специальный раствор, предохраняющий их от
охлаждения и высыхания. Полученный патологический материал
должен быть использован для посевов не позднее, чем через
2-4
часа после взятия проб.
Возбудитель коклюша А perftissfc- мелкая грамотрицательная
овоидная
палочка
(коккобактерия).
При
культивировании
бордетелл в культуральной среде накапливаются жирные
кислоты, ингибирующие их рост. В связи с этим в среды для
выращивания бордетелл вносят адсорбенты - активированный
уголь, крахмал, альбумин и др., поглощающие вредные для их
роста продукты метаболизма. Для культивирования возбудителя
коклюша обычно используют среду Борде-Жан ly и казеиново
угольный агар (КУА). Скорость роста составляет обычно от 3 до
5 суток. На среде Борде-Жангу коклюшная па
1
ючка образует
небольшие (1 мм в диаметре) сероватые, выпуклые и блестящие
колонии, напоминающие капельки ртути или жемчужины,
окружённые
зоной слабого
гемолиза.
На КУА колонии
блестящие, серовато-кремового цвета.
В
диагностике
коклю ш а
применяются
как
бактериологические, так и иммунологические методы.
Для вьщеления культуры возбудителя используют мокроту
и слизь из зева. Для засева можно применять метод «кашлевых
пластинок» (подносят чашку со средой ко рту больного во время
приступа кашля, избегая контаминации слюной, мокротой и
рвотными массами), либо производить забор слизи специальным
тампоном. Материал берут с задней стенки глотки, стараясь не
прикасаться к слизистой оболочке щёк, языка и миндалин.
Доставку патологического материала в лабораторию для посевов
необходимо осуществить в течение 2-4 часов.
Антигены
возбудителя
можно
выявлять
в
РА
со
специфическими видовыми сыворотками (с неадсорбированными,
либо с адсорбированными монорецепторными сыворотками). Для
экспресс-диагностики
используют
сыворотки,
меченные
флюоресцеинами. В случае невозможности вьщелить возбудитель,
либо
при
проведении ретроспективных эпидемиологических
обследований выявляют специфические антитела в сыворотке
больных в реакциях агглютинации, РСК и др.
Занятие № 26
С П И РО Х Е ТЫ . БА РТ О Н Е Л Л Ы . О РИ ЕН Ц И И . ЭРЛИХИ.
РИ К К Е ТС И И . ХЛАМ ИДИИ. М И К О П Л А ЗМ Ы ^
М икробиологическая диагностика сифилиса, леитоспироза,
боррелнозов, риккетсиозов, хламидиозов, микоплазмозов
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Постановки
и
учёт
реакции
связывания
комплемента
(повторение навыка для его закрепления).
2. Проведение и учёт объёмной реакции агглютинации для
определения титра антител (повторение навыка для его
закрепления).
3. Иммунопрепараты (повторение навыка для его закрепления).
86
87