ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 30.10.2019
Просмотров: 3967
Скачиваний: 33
Занятие № 5
Ф И ЗИ О Л О ГИ Я П РО К А РИ О Т (П РО ДО ЛЖ ЕН И Е).
БА К Т Е РИ О Ф А ГИ
Культуральный метод исследования. Фаготинирование бактерий
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Засев патологического материала на пластинчатый МПА
петлей с целью получения отдельных (изолированных)
колоний.
2. Индикация типа колоний (S- или R-) на пластинчатом МПА.
3. Пересев части колонии на скошенный МПА.
4. Пересев бактериальной культуры со скошенного МПА на среду Гисса.
5. Расчёт концентрации бактериофага по методу Грациа.
6. Фаготинирование бактерий.
Засев патологического материала на пластинчатый МПА петлей
с целью получения отдельных (изолированных) колоний
1. Для засева используйте чашку Петри (или несколько чашек)
с застывшим и подсушенным агаром и пробирку с
патологическим материалом.
2. В правую руку возьмите бактериологическую петлю и
стерилизуйте ее в пламени спиртовки.
3. В левую руку возьмите пробирку с патологическим
материалом, откройте, пронесите открытую часть пробирки
через пламя спиртовки, прожигая (фламбируя) края.
4. Введите петлю в пробирку, охладите ее, касаясь изнутри
стенок пробирки.
Рис. 12. Метод забора патологического материала для засева (а)
и стерилизация краев пробирки после засева (б)
18
5. Похрузите
прокаленную
и
охлажденную
петлю
в
патологический материал, стряхните избыток жидкости
(прикасаясь несколько раз к внутренней стенке пробирки),
пронесите
открытую
часть
пробирки
через
пламя
спиртовки, прожигая края, закройте пробкой, поставьте в
штатив.
6. Левой рукой приоткройте крышку чашки Петри. Визуально
разделите поверхность агара на четыре сектора. Внесите
петлю с исследуемым материалом и сделайте параллельные
штрихи по
V*
поверхности агара, скользя петлей от одного
до другого края сектора. Петлю держите плашмя, не царапая
питательной среды.
7. По окончании первой серии посева петлю обожгите,
поверните чашку против часовой стрелки приблизительно
на 90°С и сделайте следующую серию параллельных
штрихов по незасеянной поверхности агара, начиная от
конца предьщущего посева (серии штрихов), процедуру
повторите еще два раза, каждый раз обжигая петлю после
окончания нанесения серии штрихов.
8. По окончании посева петлю обожгите, поставьте в штатив,
чашку переверните вверх дном и поставьте в термостат на
24 ч при температуре 37°С.
19
Засев штрихом для получения
изолированного роста: засев
первого сектора
изолированного роста: засев
второго сектора
изолированного роста: засев
третьего сектора
Засев штрихом для получения
изолированного роста: засев
четвертого сектора
Засев штрихом для получения изолированного роста:
результат засева (изолированный рост - в третьем и
четвертом секторах).
Рис.13. Схема засева патологического материала штрихом
для получения изолированного роста.
20
Задачам и культурального метода, к а к составной части
микробиологических
исследований,
является
выявление
возбудителя в исследуемом патологическом материале, а также
его идентификация, т.е., определение видовой принадлежности (и
если есть необходимость — внутривидовая идентификация) с
использованием
морфологических,
биохимических,
биологических и антигенных свойств возбудителя. В ходе
исследований с применением культурального метода часто
необходимо также установить чувствительность выделенных
микрюорганизмов к антимикробным препаратам, определить их
токсигенность и т.д.
Первый этап культурального метода исследования -
получение изолированного роста чистой культуры
Следует помнить, что еще до начала засева патологического
материала необходимо приготовить мазок, окрасить его по Граму
или другим методом и промикроскопировать, чтобы убедиться в
наличии возбудителя в патологическом материале. Только после
выявления в патологическом материале возбудителя производят
его высев в чашки Петри на агаризованные питательные среды
(МПА, агар Эндо, среду Левина, Плоскирева или др.) для
получения роста в виде изолированных колоний.
При выделении анаэробны х возбудителей инф екций в
случае подозрения на смешанную микрофлору в патологическом
материале первому этапу культурального метода предшествует
предварительны й этап, в ходе которого выявляют, образует ли
возбудитель споры. С этой целью патологический материал делят
на две части (помещают в две пробирки с полужидкой средой
Китта-Тароцци), одну из которых прогревают на водяной бане
при температуре +80°С. В результате вегетативные клетки
спорообразующих бактерий и
неспорогенные возбудители
погибают, а термоустойчивые споры остаются жизнеспособными.
В дальнейшем при высеве и культивировании материала из обеих
пробирок по факту наличия роста судят о том, способен ли
данный возбудитель образовывать споры (это свойство является
важным для идентификации анаэробов признаком).
Культуральный
метод
исследования
основан
на
культивировании бактерий на питательных средах, вьщелении
21
чистой культуры возбудителя и ее идентификации. Чистой
культурой называют популяцию микроорганизмов одного вида,
как правило, выращенную в виде изолированной колонии на
плотной питательной среде.
Известно, что возбудители инфекционных болезней в
организме человека, животных и во внешней среде находятся
преимущественно в составе популяций, которые включают
разнообразные микроорганизмы (в том числе, и условно-
патогенные,
и
сапрофиты).
Вьщеление
чистой
культуры
позволяет
работать
непосредственно
только
с
культурой
конкретного возбудителя и выявлять его морфологические,
культуральные, биохимические признаки, а также факторы
патогенности и др., — признаки, по совокупности которых и
определяют
видовую
принадлежность
возбудителя,
т.е.
осуществляют его идентификацию.
Для выделения чистых культур бактерий применяют
различные подходы, в том числе и принцип механического
разобщения
микроорганизмов.
В
этом
случае
получение
изолированного
роста
чистой
культуры
проводят
с
использованием серийных разведений в жидкой питательной
среде (метод Пастера), либо методов рассева по поверхности
плотной питательной среды с помощью шпателя (метод
Дригальского) или бактериологической петли (метод штриха).
Второй этап культурального метода исследования
-
накопление
чистой культуры
После получения изолированного роста чистой культуры на
втором этапе культурального метода исследования проводят
макроскопическое изучение выросших колоний в проходящем и
отраженном свете, а также с использованием микроскопа (на
малом увеличении).
Индикация типа колоний (S- или R-) на пластинчатом МПА
Колонии, выращенные на пластинчатом МПА
(агаризованной питательной среде), описывают с использованием
следующих характеристик для
S-формы:
- гладкая,
- блестящая,
- влажная,
22
- гомогенная,
- правильной формы,
- круглая,
- ровные края,
- находится на поверхности среды.
Для
R- формы:
- морщинистая,
- матовая,
- сухая,
- гетерогенная,
- неправильной формы,
- неровные края,
- врастает в среду.
Для изучения колоний чашку Петри с изолированным
ростом чистой
культуры поворачивают дном
к себе и
рассматривают колонии
в проходящем свете.
Особое внимание
обращают на следующие свойства:
а) величину колоний (крупные - более 4 мм в диаметре,
средние - 2-4 мм, мелкие - 1-2 мм);
б) форму очертаний колоний (округлая, розеткообразная,
ризоидная и др.);
в) степень прозрачности (непрозрачная, полупрозрачная,
прозрачная).
В отраженном свете
рассматривают колонии со стороны
крышки, не открывая ее, и фиксируют следующие данные;
а) цвет колоний (бесцветные или пигментированные);
б) характер поверхности (гладкая, блестящая, влажная,
морщинистая, матовая, сухая и др.);
в) характер рельефа или вид сбоку (выпуклые, погруженные
в среду, плоские, куполообразные и др.).
Для
микроскопического изучения
колоний чашку Петри
устанавливают вверх дном на предметном столике микроскопа,
опускают конденсор и с помощью объектива 8Х изучают
колонии,
характеризуя
их
структуру
(гомогенная
или
гетерогенная, зернистая и др.), а также характер краев (ровные,
волнистые, зазубренные, бахромчатые и др.).
На втором этапе культурального метода, просмотрев
23
выросшие колонии, выбирают одну из них (с соответствующими
возбудителю заболевания характеристиками) для накопления
чистой культуры. При этом из 1/3 части выбранной для
дальнейшего изучения колонии готовят мазки, окрашивают и
микроскопируют для того, чтобы убедиться, что колония
принадлежит диагностируемому возбудителю. Следующую 1/3
часть
используют для
постановки
пластинчатой
реакции
агглютинации
с
поливалентными
сыворотками,
дающими
положительную реакцию только с той группой бактерий, к
которой принадлежит выделенная чистая культура возбудителя.
В случае получения подтверждающих результатов первых
двух тестов остаток колонии пересевают на скошенный агар для
накопления чистой культуры возбудителя в достаточном
количестве.
Пересев части колонии на скошенный МПА
1. Возьмите чашку с изолированными колониями (чистой
культурой), наберите стерильной петлей материал для
засева (снимают приблизительно 1/3 колонии).
2. В левую руку возьмите пробирку со скошенным МПА (либо
со средой Рассела, Клиглера, Олькеницкого), извлеките из
нее ватную пробку и пронесите открытую часть пробирки
через пламя спиртовки, прожигая края.
3. Внесите в пробир!^ петлю с материалом, сделайте засев уколом в
столбик агара, а затем штрихом распределите материал
зигзагообразным движением по скошенной поверхности агара.
4. Пронесите
открытую
часть
пробирки
через
пламя
спиртовки, прожигая края, пробирку закройте пробкой и
поставьте в штатив.
5. Петлю нужно обязательно простерилизовать в пламени
спиртовки и также поставить в штатив.
6. Пробирки с посевами поместите в термостат.
Третий этап культурального метода исследования -
окончательная идентификация чистой культуры (изучение
ферментативных признаков)
На третьем этапе из выросшей на скошенном агаре чистой
24
культуры
снова
готовят
мазки,
окрашивают
их
и
микроскопируют для того, чтобы убедиться в том, что
накопленный
материал
принадлежит
диагностируемому
возбудителю. Часть накопленной чистой культуры используют
для постановки пластинчатой реакции агглютинации с более
специфическими,
моновалентными
сыворотками,
дающими
положительную реакцию только с тем видом и сероваром
бактерий, к которому принадлежит вьщеленная чистая культура
возбудителя. При получении подтверждающих результатов обоих
тестов
проводят
окончательную
идентификацию
чистой
культуры. Например, для выявления ферментов, расщепляющих
углеводы, используют дифференциально-диагностические среды
Г исса.
Пересев бактериальной культуры со скошенного МПА
на среду Г исса
1. Для посева используют пробирки со средой Гисса.
2. Стерильной петлей производится забор небольшого
количества материала чистой культуры, выращенной
(накопленной) на скошенном агаре и делается посев
уколом в пробирку со средой Гисса.
3. При засеве среды Гисса нужно помнить о необходимости
стерилизовать петлю перед забором материала и после
посева, а также фламбировать (прожигать) края обеих
пробирок перед забором материала и посевом, и после
забора материала и посева.
Для
определения
способности
микроорганизмов
ферментировать углеводы используют короткий и длинный
«пестрый» ряд Гисса. Первый включает в себя среды с моно- и
дисахаридами: глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и с
шестиатомным спиртом - маннитом.
В длинный «пестрый» ряд вводят дополнительно среды с
моносахаридами: с арабинозой, ксилозой, рамнозой, галактозой и
др.,
а
также
с
полисахаридами
(инулином,
крахмалом,
гликогеном и др.) и спиртами (глицерином, дульцитом, инозитом
и др.). В качестве индикатора во все среды добавляют реактив
Андреде или другой индикатор кислотности среды.
25
Среды
Гисса
относятся
к
дифференциально
диагностическим,
поскольку
позволяют дифференцировать
бактерии по скорости их роста, биохимической активности и
другим признакам. В случае, если бактерии хотят различить по
способности
использовать
для
своего
роста,
т.е.
метаболизировать, тот или иной субстрат в состав сред, кроме
питательных веществ, обычно включают данный субстрат, по
отношению
к
которому
дифференцируются
бактерии,
и
индикатор.
В
результате
культивирования
бактерии,
ферментирующие субстрат, способствуют накоплению продуктов
расщепления,
сдвигу
pH,
редокс-потенциала
среды,
что
сопровождается окрашиванием среды, на которой выращивают
бактерии, а часто и их колоний в цвет индикатора. Все это
позволяет
использовать
дифференциально-диагностические
среды не только для ее выделения, но и одновременно проводить
первичную идентификацию культуры по ряду биохимических
признаков.
Например,
способность
чистой
культуры
энтеробактерий утилизировать лактозу - по изменению цвета
колоний (а иногда и среды вокруг них) при получении роста
чистой культуры на агаре Эндо, среде Левина или Плоскирева.
Среда Эндо,
помимо мясопептонного
агара (МПА),
включает лактозу, сульфид натрия и основной фуксин. При
нейтральном значении pH среда имеет бледно-розовый цвет
(практически бесцветна). При росте на среде энтеробактерий,
способных метаболизировать лактозу, что приводит к сдвигу pH,
цвет среды вокруг колоний и сами колонии преобретают тёмно
бордовую окраску.
Среда Левина
также содержит МПА и
лактозу, но в нее добавляют другие красители: эозин в смеси с
метиленовым синим, поэтому цвет среды — красновато
фиолетовый. Колонии лактозоположительных бактерий при
росте на этой среде приобретают синий цвет с металлическим
блеском.
Среда Плоскирева
является селективной для вьщеления
шигелл и сальмонелл. В состав среды, помимо мясопептонного
агара и лактозы,
входят такие компоненты, как индикатор
нейтральный красный, соли желчных кислот, бриллиантовый
зеленый и йод. На этой среде полностью ингибируется рост
26
грамположительных бактерий, и замедляется (на сутки) рост
эшерихий и другой сопутствующей микрофлоры. Готовая среда
прозрачна, имеет розовато-желтоватый цвет. Изменение pH в
кислую сторону при росте утилизирующих лактозу бактерий
приводит к образованию колоний бруснично-красного цвета.
При диагностике заболеваний, вызванных энтеробактериями
тифо-паратифозной группы, на первом этапе культурального
метода можно использовать
висмут — сульфитный агар —
мясопептонный агар, содержащий соли висмута, сульфат железа
и бриллиантовый зеленый. Бактерии, образующие сероводород,
при росте на этом агаре образуют колонии практически черного
цвета.
При проведении второго этапа культурального метода -
накопления чистой культуры возбудителя - также можно
использовать среды накопления и первичной дифференциации.
Среда Рессела,
например, содержит агар, лактозу, глюкозу,
индикатор
Андреде.
При
засеве
энтеробактерий,
ферментирующих глюкозу и лактозу, в эту среду (уколом и по
скошенной поверхности агара) происходит изменение цвета всей
среды (и столбика, и скошенной части). Бактерии, инертные к
лактозе, дают изменение цвета только в глубине среды (только
столбика),
причем
представители
энтеробактерий,
ферментирующие глюкозу с образованием кислоты и газа,
вызывают еще и образование пузырей и трещин в толще среды.
На следующей среде накопления и первичной дифференциации,
среде Клиглера
(среда содержит агар, лактозу, глюкозу,
сульфат
железа
и индикатор Андреде), можно вьывлять способность
бактерий образовывать H
2
S - по почернению среды в результате
образования сульфида железа из сульфата железа в присутствии
сероводорода. В данном случае появляется черное окрашивание
(сульфид железа имеет черный цвет) в виде темной линии по
месту прокола среды, сделанного при засеве, либо в случае очень
активной продукции H
2
S, - почернение всего столбика.
Среда
Олькеницкого,
помимо утилизации энтеробактериями сахаров и
продукции H
2
S, помогает проводить диагностику бактерий,
разрушающих мочевину, таких, например, как протеи. В среду
вносят краситель феноловый красный и мочевину. Все остальные
27