ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 30.10.2019
Просмотров: 3973
Скачиваний: 33
компоненты такие же, как и в среде Клиглера. При наличии
уреазной
активности
бактерии
разрушают
мочевину
с
образованием аммиака и двуокиси углерода, при этом среда
приобретает розовую окраску.
Для получения изолированного роста чистой культуры и
культивирования (выращивания) бактерий, кроме указанных
выше, могут использоваться самые разнообразные агаризованные
среды. Например, мясопептонный агар - основная
простая
(универсальная)
среда,
которая
может
применяться
для
культивирования большинства неприхотливых бактерий. Это
плотная среда,
простая
по составу, содержит: мясной экстракт,
пептон, хлорид натрия и агар-агар.
Для культивирования прихотливых бактерий, нуждающихся
в
факторах
роста,
необходимо
использовать
слож ные
обогащенные среды, которые изготавливают на основе простых,
включая в их состав кровь, гемин, сыворотку и другие добавки.
С елективны е
(элективные)
среды
используют
для
избирательного
культивирования
микроорганизмов
определенных видов при условии подавления роста других
сопутствующих микроорганизмов. Такой эффект достигается при
добавлении различных ингибиторов роста контаминирующей
микрофлоры; повышение концентрации хлорида натрия в
желточно-солевом агаре, добавление бриллиантового зеленого в
висмут-сульфитный агар и др.
Кроме
изучения
сахаролитической
активности,
у
выделенной
чистой
культуры
с
целью
окончательной
идентификации
изучают
и
другие
биохимические
характеристики. Например, протеолитическая активность может
изучаться одновременно с сахаролитической при использовании
среды Клиглера, Олькеницкого, висмут-сульфитного агара уже
на первых двух этапах культурального метода диагностики, либо
отдельно, на третьем этапе с применением других сред. На
третьем этапе культурального метода изучают активность
отдельных
ферментов,
антигенные
свойства,
фаго-
и
бактериоциночувствительность,
токсигенность
и
другие
признаки,
характеризующие
видовую
специфичность
возбудителя. При окончательной идентификации возбудителей
28
многих инфекций проводят антибиотикограмму — изучение
чувствительности к антибиотикам для правильного выбора
препарата для терапии.
Для выделения анаэробов используют полужидкие и
плотные среды.
Плотные среды,
среди которых наибольшее
распространение получили
агар Цейсслера
(кровяной сахарный
агар), сахарный агар и среда Вильсона-Блэра, используются
для
получения изолированного роста чистой культуры
анаэробов.
При этом на
среде Вильсона-Блэра
можно уже на первом этапе
культурального
метода
изз^ать
биохимическую
активность
возбудителя. Культивирование бактерий в течение 4-5 часов
вызывает почернение столбика среды за счёт образования
сульфида железа из КагЗ и FeClj, входящих в ее состав, а также
ее разрывы вследствие образования СОа из глюкозы. При
использовании плотных сред посевы анаэробов культивируют в
специальных устройствах -
анаэростатах (откуда откачивают
воздух), и заменяют его инертным газом.
Анаэробные условия можно создать химическим путём,
поместив посевы в эксикаторы, на дно которых заливают,
например,
щелочной
раствор пирогаллола,
поглощающего
кислород. При отсутствии анаэростата можно воспользоваться
посевом по
методу Фортнера.
В данном случае посевы
материала, содержащего возбудитель, производят на чашки
Петри с агаризованной питательной средой, разделённые на две
части узкой канавкой, вырезанной в агаре. На одну половину
засевают
культуру
аэробных
бактерий,
на
другую
-
анализируемые анаэробные бактерии. Края чашек заливают
парафином, чтобы прекратить поступление воздуха, и помещают
в термостат. Первоначально на чашках наблюдают рост аэробов,
а затем (после поглощения ими всего содержащегося в среде
кислорода) начинается рост анаэробов.
Полужидкие среды (обычно
Китта-Тароцци)
используют
для накопления чистой культуры
диагностируемого возбудителя.
Эту
среду,
которая
содержит
глюкозу
и
кусочки
паренхиматозных органов (для поглощения остатков кислорода
воздуха), перед посевами кипятят и быстро охлаждают, сверху
29
заливают вазелиновым или другим маслом, посев производят под
слой вазелинового масла, края пробирки парафинируют, и
пробирки помещают в термостат.
На
последнем
этапе
проводят
окончательную
идентификацию накопленной чистой культуры возбудителя,
выявляя
его
сахаролитическую
или/и
протеолитическую
активность, способность вызывать маслянокислое брожение,
продуцировать токсины и т.д.
Расчёт концентрации (титра) бактериофага в исследуемом
препарате по методу Грациа
Титрованием
фага
по
Грациа
можно
определить
концентрацию бактериофага в единице объема фагосодержащего
материала с точностью до одной фаговой частицы.
Расчет концентрации бактериофага осуществляют в несколько
этапов:
1. Готовятся
десятикратные
разведения
материала,
содержащего бактериофаг («фаг титруется»), в полужидкой
питательной среде.
2. К каждому разведению добавляется чувствительная к
данному
бактериофагу
чистая
культура
бактерий,
содержащая такое количество клеток, чтобы в случае
отсутствия литического действия бактериофага культура
дала рост в виде газона.
3. Затем содержимое каждой пробирки с полужидкой средой, с
различными разведениями фагосодержащего материала и
стандартное количество клеток чувствительной к данному
фагу бактериальной культуры заливают вторым слоем в
отдельную чашку Петри (для каждого разведения фага
используют отдельную чащку) на слой плотной питательной
среды, используемой в роли подложки.
4. Посевы инкубируют в термостате (время инкубации и
температура
соответствуют
оптимальным
показаниям,
необходимым для получения роста используемой для
культивирования фага бактериальной культуры).
5. После инкубации проводят учет результатов:
30
a) обычно
первые
разведения
бактериофага
(концентрация фаговых частиц очень высокая)
полностью лизируют (разрушают) все бактерии, и
рост
бактериальной
культуры
на
чашках
отсутствует;
b
) по мере увеличения разведений фага (концентрация
фаговых частиц в среде снижается) на чашках
появляется рост бактерий в виде газона, но на нем
наблюдаются отдельные зоны отсутствия роста в
виде бляшек («негативные колонии»), каждая из
бляшек - результат репликации одной фаговой
частицы, которая приводит к лизису бактерии;
c) для
подсчета
титра
бактериофага
следует
количество бляшек, появившихся на чашках с
ростом бактерий, умножить на то разведение
фагосодержащего
материала,
из
производился высев на данную чашку.
которого
Рис.14.
Бляшки (негативные колонии) бактериофага
Фаготипирование бактерий
1. 0,5 мл исследуемой суточной бульонной культуры бактерий
вносят в пробирку с расплавленным и охлажденным до 45°С
0,7% мясопептонным агаром, перемешивают и равномерно
распределяют по поверхности 2% мясопептонного агара в
чашке Петри.
31
2. После застывания агара чашку слегка подсушивают в
термостате, затем стеклянное дно чашки делят на квадраты,
надписывают
номера
(или
н£
1
звания)
бактериофагов,
которые будут использоваться для типирования.
3. Переворачивают чашку, приоткрывают крышку и на
обозначенные квадраты пастеровской пипеткой наносят по
одной капле соответствующих надписи фагов.
4. После суточной инкубации просматривают чашку, отмечая
те квадраты, в которых имеется лизис бактерий.
5. Фаготип бактериальной культуры определяется тем типом
(типами) фага (фагов), который (которые) вызывает ее лизис.
/ 2 9
52
52Й
73
|/
з с
55
71
\
\
А2£
47,
53,
54,
77
83Й
в5 /
1
/
а
б
Рис.15.
Фаготипирование бактериальной культуры:
а - видны зоны лизиса культуры типовыми бактериофагами,
б - примеры разметки дна чашки Петри перед изучением
чувствительности бактерий к типовому набору бактериофагов
Занятие № 6
ГЕНЕТИ1СА БАКТЕРИЙ
Изучение бактерий в живом состоянии
Методы изучения микроорганизмов в живом состоянии
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Обнаружение бактерий в препарате «раздавленная капля».
32
Обнаружение бактерий в препарате «раздавленная капля»
1. На поверхность чистого обезжиренного предметного стекла
стерильной петлей наносят 1-2 капли бульонной культуры
бактерий или другого исследуемого материала (жидкого),
содержащего культуру живых бактерий.
2. Осторожно покрывают каплю покровным стеклом: она должна
быть небольшой и не выходить за края покровного стекла.
3. Микроскопируют с приспущенным конденсором. Используют
объектив с увеличением 40х.
4. Можно также использовать иммерсионный объектив ЮОх,
нанося на покровное стекло одну каплю иммерсионного масла.
При исследовании живых бактерий следует отличать
активную
подвижность
у
отдельных
микроорганизмов,
свидетельствующую о наличии у них жгутиков (или аксиальной
нити),
от
пассивного
броуновского
движения
(движение
большого количества бактерий в одном направлении).
Д р у ги е м ет о д ы и зу ч ен и я б а к те р и й в ж и в о м с о с т о янии
Метод «висячая» капля
В данном случае используют специальные предметные
стекла с лункой и покровные стекла. Края покровного стекла
смазывают
вазелином,
в
центр
наносят
одну
каплю
бактериальной культуры. Затем предметное стекло лункой вниз
прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в
центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат
покровным
стеклом
вверх.
В
правильно
приготовленном
препарате капля должна свободно свисать над лункой, не касаясь
ее дна или края. Используя малый сухой объектив 8х, находят
край
капли,
затем
устанавливают
объектив
40х
и
микроскопируют.
33
Рис.16.
Схема приготовления препарата «висячая капля»
Прижизненная (витальная) окраска микроорганизмов
Обычно окраску живых бактерий производят метиленовым
синим, нейтральным красным и другими малоядовитыми
красителями. Для этого взвесь микробов вносят в каплю 0,001%
раствора красителя, затем готовят препарат «висячая» или
«раздавленная» капля и микроскопируют с объективом 40х.
Занятие №
7
ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Изучение микрофлоры ротовой нолостн
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Приготовление мазка и окраска его простым методом
(повторение навыка для его закрепления).
Приготовление мазка из зубного налета
1. На обезжиренное предметное стекло нанесите петлей
каплю физиологического раствора.
2. В
правую
руку
возьмите
деревянную
палочку
(зубочистку) и проведите ею между зубами и у
основания зубов, снимая небольшое количество зубного
налета.
3. Погрузите палочку в каплю физиологического раствора,
равномерно распределите зубной налет по стеклу и
приготовьте мазок в виде небольшого овала с диаметром
около 2 см.
4. Прожгите в пламени спиртовки конец палочки, потушите
и выбросьте ее в урну.
34
5. После
полного высушивания
зафиксируйте мазок.
Окраска мазка простым методом с использованием
метиленового синего
1. После охлаждения предметного стекла нанесите 1-2 капли
водного раствора метиленового синего на фиксированный
мазок (чтобы он был полностью покрыт краской).
2. Окрашивайте в течение 2-3 минут.
3. Смойте краску водой.
4. Просушите препарат фильтровальной бумагой.
1 - лептотрих,
2 - лактобактерии,
3 - зубная трепонема,
4 - боррелия,
5 - стрептококк,
6 - палочковидные
бактерии
Рис. 17.
Микрофлора зубного налета
При изучении состава микрофлоры ротовой полости нужно
учитывать, что в полости рта на микроорганизмы действуют
разнообразные факторы, например, слюна, которая механически
удаляет бактерии, кроме того, на них может действовать
антимикробное вещество, содержащееся в слюне - лизоцим,
вызывающее гибель бактериальной клетки. Бактерии могут
удаляться с пищей, во время чистки зубов, питья и т.д. Несмотря
на это, в полости рта всегда есть области, колонизированные
микроорганизмами - представителями нормальной микрофлоры,
такие как десневые карманы, щели между зубами, зубной налет и
т.д. От 30 до 60% всей нормальной микрофлоры ротовой полости
составляют стрептококки: в эпителии щёк обитает
Streptococcus
mitis. Streptococcus salivarius
обнаруживают в сосочках языка.
Streptococcus sanguis
и
Streptococcus mutans -
в зубном налёте на
поверхности зубов. Даже в слюне, обладающей высоким
35
антимикробным потенциалом, количество микробных клеток
может достигать 10^ на 1 мл. В ротовой полости обнаруживают
актиномицеты, а также анаэробных представителей микрофлоры,
таких как бактероиды, лептотрихи, фузобактерии и вейлонеллы.
Анаэробы колонизируют наименее аэрируемые участки: между
зубами и десневые карманы. В полости рта также обитают
спирохеты родов боррелия
(Borrelia buccalis)
и трепонема
(Treponema denticola),
а также микоплазмы:
М. orde
и
М. salivarium),
грибы рода
Candida
и др.
Представители случайной микрофлоры,
в том числе
патогенные, могут попадать в ротовую полость в результате
аэрогенного
либо
алиментарного
заражения
и
вызывать
инфекционные заболевания. Постоянные обитатели полости рта
также обладают патогенным потенциалом и при определенных
условиях способны вызвать местное повреждение тканей.
Важную роль в развитии инфекций играют кислые метаболиты
(органические
кислоты),
образующиеся
при
ферментации
микроорганизмами углеводов. Основные заболевания зубов и
полости рта (кариес, пульпиты, периодонтиты, гингивиты,
стоматиты) вызывают стрептококки (особенно
Streptococcus
mutans),
пептострептококки,
вейлонеллы,
актиномицеты,
лактобациллы, коринебактерии и др.
Занятие № 8
ОСНОВЫ УЧЕНИЯ ОБ ИНФЕКЦИИ
Биологический метод исследования
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Определение вирулентности бактериальной культуры по
косвенным признакам (наличие гемолитической активности,
наличие
лецитиназной
активности,
наличие
плазмокоагулазной активности).
Определение вирулентности бактериальной культуры по
наличию гемолитической активности
Определение
гемолитической
активности
проводят,
выращивая бактерии на кровяных агаризованных средах, на
которых при росте гемолитических штаммов вокруг колоний
36
появляются зоны просветления. При этом вокруг колоний а-
I смолитических бактерий зоны просветления незначительны и
и|)иобретают зеленоватую окраску, а вокруг Р-гемолитических
образуются прозрачные, хорошо выраженные зоны гемолиза.
Гемолизины - это факторы вирулентности, поскольку они
повышают проницаемость мембраны эритроцитов, вызывая их
гемолиз. Некоторые бактерии продуцируют гемолизины -
(|)срменты, разрушающие эритроциты. Причем разрушение
)ритроцитов может быть как неполным с сохранением клеточной
с'громы — а —гемолиз, так и полным, с полным разрушением
)ритроцитов - р-гем олиз. Г ам м а-гем олитические бактерии
иообще гемолиза не вызывают.
Альфа-гемолиз характерен для пневмококка, а также для
группы
зеленящих
стрептококков.
Высоковирулентные
Staphylococcus aureus и Streptococcus pyogenes являются р -
I емолитическими.
Определение вирулентности бактериальной культуры
по наличию лецитиназной активности
Для определения лецитиназной активности проводят посевы
изучаемой бактериальной культуры (как правило, стафилококка)
на желточно-солевой агар (ЖСА). Среда содержит высокие
концентрации
хлорида
натрия
(8-10% )
(повышенные
концентрации соли не препятствуют росту стафилококка, но
подавляют рост других бактерий), а также лецитин куриного
желтка.
Вокруг
колоний
стафилококка,
вьщеляющего
лецитиназу, при росте на ЖСА образуются зоны помутнения с
перламутровым оттенком.
Лецитиназа
является фактором вирулентности, поскольку
действует на лецитин мембран мышечных волокон, эритроцитов
и других клеток.
Определение вирулентности бактериальной культуры по
наличию плазмокоагулазной активности
Плазмокоагулазная активность выявляется путем посева
испытуемой культуры в стерильную разведенную (обычно в 2
раза) цитратную плазму крови. Посевы инкубируют в термостате
при температуре +37°С и через 2, 4 и 24 часа проверяют
37