Файл: Сигнальные системы клеток растений.pdf

сокой скорости оборота рецепторного белка 160 кда Имеются 

данные  об  элиситориндуцированном  синтезе  рецепторов, 

располагающихся  в  плазмалемме  [Warren  et  al  1998],  но, 

насколько известно, в настоящее время все еще отсутствует 

информация  о  степени  специфичности  синтеза  того  или 

иного  рецепторного  белка  в  зависимости  от  вида 

элиситора.

G-

БЕЛКИ

К  G-белкам  относятся  разнообразные  белки,  способные 

взаимодействовать  с  ГТФ  [Gilman,  1987].  Одной  из  важнейших 

функций G-белков является участие в функционировании целого 

ряда  сигнальных  систем  клеток  растений  (аде-нилатциклазной, 

МАР-киназной,  фосфатидатной,  кальциевой,  липоксигеназной, 

НАДФН-оксидазной).  Если  считать  первым  звеном  этих 

сигнальных  систем  трансмембранный  рецепторный  белок,  то  в 

роли  второго  выступает  гетеро-тримерный  комплекс  G-белков, 

состоящий  из  а-, (3-  и  у-субъ-единиц.  Непосредственно  с 

цитозольным  С-участком  рецептора  взаимодействует  у-

субъединица,  а  (3-субъединица  объединяет  ее  с  неактивной  а-

субъединицей,  содержащей  связанную  молекулу  ГДФ.  При 

связывании  лиганда,  например  элиситора,  с  внешним  (N) 

участком  трансмембранного  рецептора  происходит  изменение 

его  конформации,  которое  передается  на  ассоциированный  с 

ним  гетеротример-ный  комплекс  G-белков.  В  результате 

изменения  конформации  последнего  происходит  реакция 

переноса концевого фосфата цитоплазматического ГТФ на ГДФ, 

связанный  с  а-субъединицей,  что  приводит  к  ее  активации, 

выходу  из  комплекса  и  взаимодействию  с  аденилатциклазой  или 

другим  стартовым  сигнальным  ферментом,  что  обусловливает 

активацию  этого  фермента.  Через  сравнительно  непродолжи-

тельное время происходит дефосфорилирование ГТФ, входящего 

в  состав  а-субъединицы  (ее  переход  в  неактивную  форму),  и 

восстановление  исходной  структуры  неактивного  комплекса, 

связанного  с  рецептором.  Такие  циклические  преобразования, 

сопровождающиеся  превращением  цито-зольного  ГТФ  в  ГДФ, 

обеспечивают  как  передачу  сигнала  от  рецептора  к  первому 

ферменту  той  или  иной  сигнальной  системы,  так  и  прерывание 

через некоторое время сигналь-

ной цепи, что также является необходимым условием эф-

фективной работы любой  сигнальной  системы.  Необходи-

мо заметить, что прерывание сигнальных цепей достигается 

и  с  помощью  других  механизмов,  о  которых  будет  упоми-

наться в следующих главах.

Описанная  картина  участия  гетеротримерных  комплексов 

G-

белков в передаче сигнального импульса была основатель-

но изучена у животных объектов и давно вошла в учебники 
[Lehninger  et  al., 

1993]. В растениях эти комплексы G-белков 

также  функционируют  [Hooley,  1998;  Bischoff  et  al.,  1999], 

причем обнаружены все компоненты гетеротримерного ком-

плекса G-белков. Клонированы и охарактеризованы гены а-

субъединиц [Iwasaki et al., 1997; Aharon et al., 1998; Kaydamov et 
al., 2000; Perroud et al., 2

000], принимающих участие не только 

в  активации  первых  ферментов  сигнальных  систем 
[Chapman et al., 1998; Machady et al., 1998; Roos et al., 

1999], но 

и кальциевых каналов [Aharon et al., 1998]. Обнаружено, что 

ос-субъединица прикреплена к плазмалемме и эндоплазмати-

ческой сети, но не к мембранам ядра или хлоропластов [Weiss 
et al., 

1997]. Клонирован и охарактеризован также ген |3-субъ-

единицы [Kaydamov et al., 2000]. Подавление функционирова-

ния  гетеротримерного  комплекса  приводило  к  нарушениям 

морфологических признаков  у растений риса, в том числе к 

появлению карликовых форм [Fujisawa et al., 1999].

Помимо  "классических"  гетеротримерных  форм  G-бел-

ков у растений обнаружены также "сверхкрупные" G-белки 
[Lee,  Assmann, 

1999]  и  малые  G-белки  (small  G-proteins) 

[Mulligan  et  al.,  1997;  Palme  et  al.,  1997;  Ichinose  et  al.,  1999; 
Valster et al., 

2000], гомологичные открытым ранее у живот-

ных.  Недавно  проведена  систематизация  генов  всех  форм 
G-

белков [Bischoff et al., 1999]. Структура малых G-белков 

напоминает  а-субъединицу  гетеротримерного  комплекса. 

В их состав входят рецепторсвязывающая область и ГТФ / 

ГДФ-связывающее место.

Функции малых G-белков в растениях в настоящее вре-

мя интенсивно изучаются. Обнаружено, что они принимают 

участие  в  организации  актинового  цитоскелета,  образова-

нии  активных  форм  кислорода  (функционировании 

НАДФН-оксидазы)  и  апоптозе  клеток  [Kawasaki  et  al., 

1999], входе ионов кальция в клетки [Н. Li et al., 1999], акти-

вации фосфолипазы Д [Holbrook et al., 1999; С. Wang, 2000;

X. Wang, 200

0]. Для изучения участия G-белков в различных 

сигнальных цепях клеток часто используют активатор G-

белков  -  мастопаран  [Blumwald  et  al.,  1998;  Chapman  et  al., 
1998; Machady et al., 1998; Roos et al., 1999].

Участие  в  сигнальных  системах,  включаемых  элисито-

рами,  предполагает  достаточно  важную  роль  G-белков  в 

выработке защитных реакций клеток растений по отноше-

нию к патогенам. В связи с этим обращают на себя внима-

ние  факты  патоген-  и  элиситориндуцированного  образова-

ния  G-белков  [Ichinose  et  al.,  1999]  и  обнаруженных  ранее 
[Ueda et al., 

1998] ингибиторов диссоциации комплексов G-

белков [Kim et al., 1999].

Представляется  необходимым  отметить  роль  фермента-

тивного липидирования и делипидирования в функциониро-

вании мембранных рецепторов и G-белков. Прикрепление 

белков  к  мембранам  осуществляется  с  помощью  пост-

трансляционно  приобретенных  гидрофобных  остатков,  ко-

торые погружаются в липидный материал мембран, выпол-

няя  роль  корешков,  удерживающих  большую  молекулу 

белка  на  мембране.  Ферментативное  отщепление  гидро-

фобного (липидного) остатка переводит белок из связанного 

с  мембраной  состояния  в  свободное,  что  может  сущест-

венно изменить функции этого белка [Casey, 1995]. Деталь-

ный  механизм  регуляции  активности  этих  ферментов  оста-

ется недостаточно выясненным.

Обнаружено,  что  16-углеродные  остатки  пальмитино-

вой кислоты могут быть перенесены на белок с образовани-

ем тиоэфирной связи с цистеином белка.

Пальмитоил-S-KoA + HS-белок —> 
—

> Пальмитоил-Б-белок + HS-KoA

Пальмитоильный  остаток  может  впоследствии  заме-

щаться  ацильными  остатками  других  жирных  кислот.  При 

переносе на белок остатка 14-углеродной миристиловой ки-

слоты  она  взаимодействует  с  аминогруппой  N-концевого 

глицина  с  помощью  N-миристоилтрансферазы.  Еще  один 

способ усиления связывания с мембранами различных бел-

ков - их пренилирование, осуществляющееся путем переноса 
15-

углеродного  фарнезильного  или  20-углеродного  гера-

нилгеранильного остатков на HS-группу цистеина, располо-

женного близ С-конца белка.

О  роли  прикрепления  к  белкам  гидрофобных  остатков 

можно  судить  по  следующим  фактам.  Депальмитоилирова-

ние мембранных рецепторов может способствовать их осво-

бождению из  плазмалеммы,  что  приведет к  невозможности 

восприятия элиситорных сигналов. Известна важная роль в 

функционировании  сигнальных  систем  "липидированных" 
G-

белков,  осуществляющих  передачу  сигнального  импульса 

от мембранных рецепторов к стартовым ферментам сигналь-

ных  цепей.  Обратимое  пальмитоилирование  ос-субъединицы 

этого  белка  может  изменять  его  сигнальную  активность.  у-

Субъединица  G-белка  пренилирована,  и  это  определяет 

связь с мембраной комплекса у- и р-субъединиц. Могут быть 

пренилированы и малые G-белки, также участвующие в пе-

редаче  и  преобразовании  элиситорных  сигналов  от  рецепто-

ров  к  интермедиатам  сигнальных  цепей.  Опубликовано  не-

сколько  работ  с  описанием  элиситориндуцированного  пере-

хода некоторых белковых интермедиатов сигнальных систем 

из растворимого (в цитозоле) состояния в связанное с плаз-

малеммой,  что,  по-видимому,  определялось  их  липидироваи-

ем.  Примером  может  служить  переход  фосфолипазы  D  из 

растворенного  в  мембраносвязанное  состояние,  вызванный 

действием  экзогенной  абсцизовой  кислоты  [Ryu,  Wang, 

1995]. В связывании с мембранами кальцийзависимых проте-

инкиназ  играет  большую  роль  меристоилирование  N-конца 

молекулы [Hrbak et al., 1996; Romeis et al., 2000].

Сравнительно недавно стало ясно, что большую роль во 

внутриклеточном  преобразовании  сигналов  играют  вспо-

могательные  белки,  не  преобразующие  сигналы,  но  имею-

щие "стыковочные" домены, способные связывать сигналь-

ные белки. В связи с тем, что один вспомогательный белок 

может  иметь  несколько  одинаковых  или  отличающихся 

стыковочных (достаточно консервативных)  доменов, то он 

может  обеспечивать  формирование  достаточно  сложного 

белкового  комплекса,  облегчающего  взаимодействие  меж-

ду  звеньями  сигнальных  цепей,  такими  как,  например,  ре-

цепторы,  G-белки,  протеинкиназы,  факторы  регуляции 

транскрипции,  протеинфосфатазы,  цитоскелетные  белки, 

такие  ферменты,  как  NO-синтаза.  Взаимодействие  между 

вспомогательными белками, а также между ними и сигналь-

ными  белками  регулируется  с  помощью  различных  меха-

низмов, одними из которых являются реакции фосфорили-

рования-дефосфорилирования   определенных   остатков 

аминокислот в белках.

Вспомогательные белки подразделяются на объединяю-

щие (scaffold), заякоривающие (anchoring) и адапторные 
IPawson, Scott, 

1997]. Если в двух последних типах белков 

обычно взаимодействуют два партнера, то в первом объе-

диняющий белок "навешивает" на себя несколько сигналь-

ных белков. У дрозофилы был найден ген, кодирующий 

объединительный белок с пятью "стыковочными" PDZ-до-

менами, обеспечивающий организацию сигнального комп-

лекса. Мутации этого гена (даже в области одного PDZ-до-

мена) приводят к серьезным нарушениям распределения 

сигнальных молекул внутри клеток.  Вышеупомянутый 

белок обеспечивает преобразование светового сигнала в 

светочувствительной клетке глаза дрозофилы. С помощью 

пяти модулей (PDZ) он связывает в единый комплекс гете-

ротримерный G-белок (взаимодействующий с фоторецеп-

тором родопсином), фосфолипазу С, протеинкиназу С, 

кальциевый канал, кальмодулин [Tsunoda et al., 1997]. Можно 

ожидать, что у растений имеются подобные объединяющие 

белки, если исходить из принципа унификации структуры и 

функций как генома, так и обслуживающих его механизмов 

[Гречкин, Тарчевский, 2000]. Кроме того, уже обнаружены 

однотипные обслуживающие белки у растений и животных, 

например адапторный димерный белок 14-3-3, каждая субъ-

единица которого узнает и связывает фосфосериновый 

остаток одного из двух различных сигнальных белков, в ре-

зультате чего происходит их объединение в единый функ-

ционирующий сигнальный комплекс. Ключевыми для свя-

зывания могут быть и фосфотирозиновые остатки. Один из 

типов стыковочных доменов имеет полипролиновую после-

довательность аминокислот. Усиливает способность обра-

зовывать сигнальные олигомеры обратимое преобразова-

ние сульфгидрильных групп остатков цистеина в межмоле-

кулярные дисульфидные в N-концевой области взаимодей-

ствующих сигнальных и вспомогательных белков [Pawson, 
Scott, 

1997]. Функционированием вспомогательных белков 

объясняют явления локализации и кластеризации рецепто-

ров и ионных каналов, а также специфику реализации одно-

го и того же сигнала в клетках различных тканей.

ПРОТЕИНКИНАЗЫ И ПРОТЕИНФОСФАТАЗЫ

Эффективным  и  широко  распространенным  способом 

изменения активности ферментов и других белков является 

один из видов их посттрансляционной модификации - фос-

форилирование входящих в них аминокислот. Так как оста-

ток  ортофосфорной  кислоты  обычно  (в  условиях  внутри-

клеточного  диапазона  рН)  несет  отрицательный  заряд,  то 

его  появление  в  белке  приводит  к  изменению  суммарного 

локального электрического заряда и в связи с этим конфор-

мации  и  активности  белка.  Реакции  фосфорилирования 

белков  катализируют  различные  виды  протеинкиназ,  кото-

рые привлекают большое внимание исследователей в связи 

с их ключевой ролью в регуляции функционирования кле-

ток, в том числе в работе сигнальных систем [Hardie, 1999; 
Schenk, Snaar-Jagalska, 

1999]. Описанию принципов строения 

и классификации протеинкиназ посвящен целый ряд обзор-

ных  статей  [Hunter,  1995;  Stone,  Walker,  1995;  Hardie,  1999; 
Walker-Simmons,  1998;  Hardie,  1999;  Jouannic  et  al., 1999b; 
Cohen, 

2000; и др.].

В  настоящее  время  у  эукариотических  организмов  опи-

сано  около  1000  представителей  этих  ферментов  [Hardie, 
199

9], причем почти половина из них -  у растений [Cohen, 

2000]. Эти ферменты катализируют реакцию переноса кон-

цевого  ортофосфата  от  АТФ  на  некоторые  аминокислот-

ные остатки белков:

Белок + АТФ —> Белок-Ф + АДФ

Все  протеинкиназы  подразделяются  на  пять  подсе-

мейств, в зависимости от тех остатков аминокислот, кото-

рые  они фосфорилируют  в  белках-субстратах  протеинки-

назных  реакций  [Hardie,  1999]:  рецепторные  двухкомпо-

нентные гистидиновые протеинкиназы с автокаталитиче-

ским переносом фосфатного остатка с гистидина на собст-

венный  аспартат;  гистидиновые;  серин-треонинспецифич-

ныe;  тирозиновые;  протеинкиназы  двойной  специфично-

сти, способные функционировать и как серин-треониновые, 

и  как  тирозиновые.  Многие  представители  этих  подсе-

мейств  принимают  участие  в  функционировании  сигналь-

ных систем клеток растений.

За  последние  годы  большинство  генов  протеинкиназ 

клонировано  (только  у  арабидопсиса  -  около  200),  и  пер-

вичная  структура  как  этих  генов,  так  и  кодируемых  ими 

протеинкиназ была расшифрована, что позволило рассмат-

ривать вопросы молекулярной эволюции этих ферментов 
| Hardie, 

1999] и их структурной принадлежности к различ-

ным семействам и подсемействам. Сопоставление функцио-

нальных особенностей различных протеинкиназ позволило 

провести  дополнительную  классификацию  этих  фермен-

тов,  подразделить  их  на  следующие  подсемейства  (здесь 

приводятся главным образом те из них, которые имеют не-

посредственное  отношение  к  функционированию  сигналь-

ных систем): кальцийзависимые; АМФ-зависимые (при го-

лодании клеток снижается содержание АТФ и повышает-

ся  -  АМФ,  что  активирует  протеинкиназы  этой  группы), 

обозначаемые также как SNF PK (sucrose non-fermenting pro-
tein  kinases); 

рецепторные  киназы,  образующие  активные 

гомо- или гетеродимеры после связывания с сигнальными 

молекулами  (лигандами);  митоген-активируемые  протеин-

киназы, причем у арабидопсиса клонировано семь МАР-ки-

наз и по пять МАР-киназ киназ и МАР-киназ киназ киназ; 

циклинзависимые  протеинкиназы  (активируемые  белками-

циклинами), принимающие участие в прохождении клеточ-

ных  циклов;  казеиновые  киназы,  принимающие  участие, 

например, в фосфорилировании факторов регуляции транс-

крипции и стимулировании их связывания с промоторными 

участками генов; протеинкиназы группы CTR 1/Raf, прини-

мающие участие в "сопряжении" ГТФ-связывающего белка 
(G-

белка)  Ras  с  МАР-киназами,  в  частности,  в  индуцируе-

мом этиленом МАР-киназном сигнальном каскаде.

Протеинкиназы  различных  семейств  имеют  довольно 

консервативную  структуру  каталитического  домена,  менее 

консервативную структуру регуляторного и наиболее вари-

абельную - распознающего субстраты домена, что позволя-

ет ему "узнавать" очертания субстратных участков белков-

мишеней. Структура регуляторного домена различных про-

теинкиназ  определяет  их  способность  взаимодействовать  с 

определенными  молекулами  эффекторов,  в  роли  которых 

могут  выступать  различные  вторичные  посредники  сиг-

нальных систем клеток. Это приводит к активированию или 

инактивированию  протеинкиназ  и  изменению  интенсивно-

сти преобразования и передачи по  сигнальной цепи  элиси-

торного  сигнального  импульса.  Активация  различных  изо-

форм  протеинкиназ  может  осуществляться  ионами  каль-

ция,  Са

2+

-

кальмодулиновым  комплексом,  циклическими 

АМФ и ГМФ, диацилглицеринами и другими, ингибирова-

ние  -  таннинами,  флавоноидными  соединениями,  искусст-

венными синтетическими ингибиторами.

Белки-представители  некоторых  групп  протеинкиназ 

состоят из гетеротримерных комплексов, причем каждая из 

субъединиц комплекса (сс-каталитическая, (3-регуляторная 

и  у-узнающая субстрат) соответствует  упоминавшимся вы-

ше доменам одномолекулярных протеинкиназ.

Повышение  концентрации  активатора  или  ингибитора 

протеинкиназных реакций может сильно отразиться на на-

правленности  обмена  веществ  клеток,  так  как  в  качестве 

субстратов  протеинкиназных  реакций  выступают  различ-

ные ферменты, белки-участники сигнальных систем клеток 

(в том числе сами протеинкиназы), белки не только цитозо-

ля, но и мембран, например, белки ионных каналов и ион-

ных помп.

Ключевую  роль  в  функционировании  сигнальных  сис-

тем  клеток  играют  не  только  реакции  фосфорилирования 

белков,  но  и  обратные  реакции  их  дефосфорилирования, 

катализируемые  протеинфосфатазами  и  возвращающие  ак-

тивность белков-субстратов в исходное состояние:

Белок + Фн

Протеинфосфатазы растений подразделяют  на несколь-

ко групп, при этом в основу классификации положено сход-

ство (или различие) последовательности аминокислот в до-

менах ферментов [Rodriguez, 1998]. Гены многих протеин-

фосфатаз были клонированы, и их первичная структура оп-

ределена.  Обнаружена  чрезвычайно  высокая  консерватив-

ность протеинфосфатаз, что подтверждает представление о

впжности исследуемых ферментов в осуществлении функ-

ций клеток.

Протеинфосфатазы  подразделяются  на  низкомолеку-

лярные  цитоплазматические  и  высокомолекулярные  ре-

цепторные  [Буланова,  Будагян,  1994]  классы.  Первые 

включают в себя два подкласса: серин-треониновые и тиро-

зиновые фосфатазы.

Серин-треониновые  протеинфосфатазы  (ПФ)  растений 

(гомологичные обнаруженным у животных) подразделяются 

на  три  типа:  ПФ1,  ПФ2А  и  ПФ2С  (РР1,  РР2А  и  РР2С). 

Протеинкиназы  типа  2В  (РР2В),  характерные  для  живот-

ных, в растениях еще не клонированы, но опыты со специ-

фическим  ингибитором  этих  ферментов  позволяют  счи-

тать, что этот тип протеинфосфатаз присутствует и у расте-

ний [Schreiber, 1992]. Еще одно различие в том, что у РР2С 

не  обнаружено  регуляторной  субъединицы.  По-видимому, 

се роль могут играть различные белки, являющиеся мише-

нями  для  фермента.  Активность  каталитической  субъеди-

ницы у РР2В регулируется и кальцием, и кальцийсвязываю-

щим белком - гомологом кальмодулина [Klee et al., 1988].

Рецепторные  протеинфосфатазы  имеют  достаточно 

консервативный  трансмембранный  домен  и  подразделяют-

ся  на  несколько  классов  в  зависимости  от  структуры  и 

свойств  внеклеточного  и  цитоплазматического  фосфатаз-

ного  доменов.  Первый  может  содержать  гликозильные  ос-

татки или богатые серином участки.

Дополнительное  свидетельство  различий  протеинфос-

фатаз в том, что они по-разному относятся к ингибиторам и 

ионам. Так, протеинфосфатазы РР2С требовали для своей 

активации ионы Mg

2+

и Мп

2+

и не реагировали на окадаевую 

кислоту - сильный ингибитор активности протеинфосфатаз 

типа РР1 и PP2A[Cohen, 1989; Rodriguez, 1998].

Расшифровка  первичной  структуры  протеинфосфатазы 

типа  РР2С  у  растений  (главным  образом,  у  арабидопсиса) 
[Rodriguez,  199

8] позволила сделать вывод, что у них глав-

ные  различия  определяются  вариациями  аминокислотного 

состава  на  N-конце  молекул.  Например,  у  КАРР  (kinase 
associated protein phosphatase) 

домен KI связывается только с 

фосфорилированной  формой  рецепторных  протеинкиназ  и 

дефосфорилирует  их,  прерывая  передачу  сигнального  им-

пульса.

Протеинфосфатаза

Белок-Ф