Файл: Сигнальные системы клеток растений.pdf

АВ11 и АВ12 играют ключевую роль в АБК-индуциро-

ванном сигнальном пути [Merlot, Giraudat, 1997; Gosti et al., 

1999].  Наблюдались  рН-зависимая  и  М§

2+

-

зависимая  акти-

вация ABU [Leube et al., 1998].

У  протеинфосфатаз  МР2С  основной  мишенью  является 

МАРККК, активируемая при воздействии различных стрес-

соров.  Такая  специфика  становится  объяснимой,  если 

учесть, что  у некоторых протеинфосфатаз обнаружены ме-

ста  связывания  с  соответствующими  им  протеинкиназами 
[Williams et al., 1997; Li J. et al., 1999] - 

участниками сигналь-

ных систем клеток.  Это позволяет  обеспечивать существо-

вание комплекса протеинкиназа-протеинфосфатаза и  свое-

временно и эффективно блокировать преобразование и пе-

редачу в геном сигнального импульса. Принцип работы этого 

механизма  достаточно  прост:  накопление  определенной 

протеинкиназы  -  интермедиата  сигнальной  цепи  -  активи-

рует фосфопротеин-фосфатазу и приводит к  дефосфорили-

рованию (инактивации) протеинкиназы. Например, актива-

ция некоторых протеинкиназ может привести к фосфори-

лированию  и  активации  соответствующих  протеинфосфа-

таз.  При  исследовании  функционирования  протеинфосфа-

таз  часто  используют  специфические  ингибиторы,  напри-

мер окадаевую кислоту и каликулин [Li et al., 1994b].

ФАКТОРЫ РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ

Синтез  матричных  РНК  катализируется  ДНК-зависи-

мыми  РНК-полимеразами'-  одними  из  наиболее  крупных 

белковых комплексов, состоящих из двух больших и 5-13 

малых субъединиц, что определяется сложностью и важ-

ностью  их  функций.  Эти  субъединицы  имеют  консерва-

тивные  последовательности  аминокислот,  в  большей  или 

меньшей степени общие для животных и растений, iАктив-

ность  РНК-полимеразы  и  узнавание  транскрибируемых 

генов регулируются с помощью нескольких типов белков. 

Наибольшее  внимание  привлекают  факторы  регуляции 

транскрипции.'  Эти  белки  способны  взаимодействовать  с 

другими  белками,  в  том  числе  с  идентичными,  изменять 

конформацию  при  фосфорилировании  нескольких  входя-

щих в их состав аминокислот,[узнавать регуляторные пос-

ледовательности нуклеотидов в промоторных участках ге-

нов, что приводит к изменению интенсивности их экспрес-

сии.: Именно факторы регуляции транскрипции направля-

ют  РНК-полимеразу  на  точку  инициации  транскрипции 

соответствующего  гена  (или  совокупности  генов),  не 

участвуя  непосредственно  в  каталитическом  акте  син-

теза мРНК.

У  животных  организмов  определены  особенности 

структуры  более  1  тысячи  факторов  регуляции  транс-

крипции. Клонирование их генов способствовало получе-

нию  информации,  позволившей  осуществить  классифика-

цию этих белков.

Все факторы регуляции транскрипции содержат три ос-

новных  домена.  Наиболее  консервативным  является  ДНК-

связывающий  домен.  Последовательность  аминокислот  в 

нем  определяет  узнавание  определенных  последовательно-

стей нуклеотидов в промоторах генов.

В  зависимости  от  гомологии  первичной  и  вторичной 

структур  ДНК-связывающего  домена  факторы  регуляции 

транскрипции  подразделяются  на  четыре  суперкласса:  1)  с 

доменами, обогащенными основными аминокислотами; 2) с 

ДНК-связывающими  доменами,  координирующими  ионы 

цинка,  -  "цинковыми  пальцами";  3)  с  доменами  типа  спи-

раль-поворот-спираль; 4) с доменами типа |3-скэффолд, об-

разующими контакты с малой бороздкой ДНК [Патрушев, 

2000].  Каждый  суперкласс  подразделяется  на  классы,  се-

мейства и подсемейства. В суперклассе 1 обращают на себя 

внимание факторы регуляции транскрипции с доменами ти-

па  "лейциновая  застежка-молния",  представляющими  со-

бой ос-спирали, у которых каждая седьмая аминокислота яв-

ляется  лейцином,  выступающим  с  одной  стороны  спирали. 

Гидрофобное взаимодействие остатков лейцина одной мо-

лекулы  с  аналогичной  спиралью  другой  молекулы  обеспе-

чивает  димеризацию  (по  аналогии  с  застежкой-молнией) 

факторов регуляции транскрипции, необходимую для взаи-

модействия с ДНК.

В  суперклассе  2  "цинковые  пальцы"  представляют  со-

бой  последовательности  аминокислот,  содержащие  четыре 

остатка  цистеина,  которые  оказывают  координирующее 

действие на ион цинка. "Цинковые пальцы" взаимодейству-

ют с большой бороздкой ДНК. В другом классе этого су-

перкласса  структура  "цинковых  пальцев"  обеспечивается 

двумя  остатками  цистеина  и  двумя  остатками  гистидина 

(рис. 5), еще в одном классе координация двух ионов цинка 

в одном "пальце" осуществляется шестью остатками цисте-

ина.  Вершины  "цинковых  пальцев"  контактируют  с  боль-

шой бороздкой ДНК.

Исследование  структуры  факторов  регуляции  транс-

крипции у растений позволило установить гомологию с бел-

ками  этого  типа,  характерными  для  животных  объектов. 

Типичные факторы регуляции транскрипции содержат сле-

дующие  три  основных  структурных  элемента:  ДНК-связы-

вающий, олигомеризационный и регуляторный домены [Liu 
et  al., 

1999]. Мономерные формы транскрипционных факто-

ров неактивны, в отличие от димерных (олигомерных). Об-

разованию  олигомерных  форм  предшествует  фосфорили-

рование мономерных форм в цитозоле, затем происходит 

их ассоциация и после этого доставка в ядро или с помощью

Рис.  5.  Структура  "цинкового  пальца" 

фактора 

регуляции 

транскрипции 

[Hardie, 1999]

Г - остаток гистидина; Ц-S - остаток 

цистеина

специальных  транспортных  белков 

или  благодаря  взаимодействию  с 

рецепторными  белками  в  порах 

ядерной  мембраны,  после  чего  они 

переносятся  в  ядро  и  взаимодейст-

вуют  с  промоторными  участками 

соответствующих  генов.  'Факторы  регуляции  транскрипции 

кодируются  мультигенными  семействами,  и  их  синтез  может 

индуцироваться  патогенами  и  элиситорами,  а  активность 

изменяться  в  результате  посттрансляционной  модификации 

(главным 

образом, 

фосфо-рилирования 

или 

дефосфорилирования).

В  настоящее  время  создана  все  более  расширяющаяся  база 

данных  о  структуре  различных  факторов  регуляции 

транскрипции  и  их  генов  у  растений  [Wingender  et  al.,  2000]. 

Показано,  что  специфичность  связывания  с  ДНК  определяется 

аминокислотными 

последовательностями 

стержневой 

и 

петлевой  зон  в  уже  упоминавшихся  лейциновых  "застежках-

молниях",  представляющих  собой  одну  из  наиболее 

многочисленных  и  консервативных  групп  эукариотиче-ских 

факторов  регуляции  транскрипции  [Niu  et  al.,  1999].  Часто 

факторы регуляции транскрипции классифицируются именно по 

структуре  ДНК-связывающих  доменов, которые  могут  включать 

спиральные  последовательности  аминокислот,  "цинковые 

пальцы"  -  участки  с  двумя  цистеино-выми  и  двумя 

гистидиновыми  остатками  или  со  многими  ци-стеиновыми 

остатками  и  т.д.  У  растений  от  одного  до  четырех  "цинковых 

пальцев"  найдены  в  ДНК-связывающих  доменах  факторов 

регуляции транскрипции [Takatsuji, 1999].

Механизм  взаимодействия  факторов  регуляции  транс-

крипции  с  ДНК-зависимыми  РНК-полимеразами  и  промо-

торными  участками  генов  остается  одной  из  ключевых  и  все 

еще недостаточно изученных проблем функционирования генома 

клеток. 

Особенно 

скудна 

информация, 

касающаяся 

растительных объектов.

Мутации  в  генах,  кодирующих  факторы  регуляции 

транскрипции у животных, могут привести к определенным 

заболеваниям [Latchman, 1997].

У растений описаны представители семейства генов, ко-

дирующих  факторы  регуляции  транскрипции  [Aso  et  al., 

1999]  с  лейциновыми  "застежками-молниями".  Было  пока-

зано, что транскрипционные факторы этого типа отвечают 

за салицилатиндуцированное образование защитных анти-

патогенных  белков  и  что  мутации  в  указанных  генах 

приводят  к  потере  способности  синтезировать  эти  белки 
[Zhang et al., 1999].

ПРОМОТОРЫ ГЕНОВ БЕЛКОВ 

СИГНАЛЬНЫХ СИСТЕМ И ЗАЩИТНЫХ БЕЛКОВ

В  настоящее  время  интенсивно  исследуется  структура 

промоторных участков генов, отвечающих за приобретение 

иммунитета к различным патогенам. Уже давно привлекает 

внимание факт практически одновременного синтеза цело-

го ряда патогениндуцируемых белков: Это может быть вы-

звано как дивергенцией сигнальных путей в одной сигналь-

ной  системе,  что  обусловливает  активацию нескольких  ти-

пов  факторов  регуляции  транскрипции,  так  и  "включени-

ем" тем или иным элиситором нескольких сигнальных сис-

тем,  которые,  функционируя  параллельно,  активируют  не-

сколько типов факторов регуляции транскрипции и, вслед-

ствие  этого,  вызывают  экспрессию  нескольких  видов  за-

щитных  белков.  Не  исключена  также  возможность  того, 

что промоторы генов  нескольких индивидуальных белков 

имеют одну и ту же структуру регуляторных элементов, что 

приводит к их одновременной экспрессии даже в случае сиг-

нальной активации одного представителя факторов регуля-

ции транскрипции.

1

Последний вариант имеет место при действии на расте-

ния стрессового фитогормона этилена, когда фактор регу-

ляции транскрипции взаимодействует с GCC-боксом промо-

торных  участков  нескольких  этилениндуцируемых  генов, 

что обеспечивает более или менее одновременное образо-

вание целой группы этилениндуцируемых белков [Thara et 
al., 

1999]. Такой принцип пакетного синтеза защитных бел-

ков реализуется при ответе клеток на различные стрессоры 

или элиситоры (к вторичным элиситорам можно отнести и 

стрессовые  фитогормоны).  Например,  при  действии  повы-

шенных температур индуцируется транскрипция группы ге-

нов, содержащих в промоторных участках общий регуля-

торный элемент HSE (heat shock element), отсутствующий у 

других  генов  [Latchman,  1997].  Эта  закономерность  была 

подтверждена  с  помощью  приема  создания  гибридных  ге-

нов с промотором гена теплового шока, состыкованного с 

другим  геном,  обычно  не  изменяющим интенсивности  экс-

прессии  при  действии  повышенных  температур.  В  случае 

же  трансгенных  растений начиналась  его  экспрессия. 

В эукариотических клетках обнаружены также промоторные 

участки  со  сходными  последовательностями  нуклеотидов  у 

различных генов, индуцируемых одним и тем же интерме-

диатом  (вторичным  посредником)  сигнальных  систем,  на-

пример циклическим АМФ. В последнем случае сигнальная 

последовательность  нуклеотидов  промоторного  участка 

имеет обозначение CRE (cyclic AMP response element).

У  арабидопсиса  обнаружена  глюкокортикоидная  систе-

ма  активации  факторов  регуляции  транскрипции,  включе-

ние  которой  приводило  к  экспрессии  патогениндуцируе-

мых защитных генов [Н. Kang et al., 1999]. Распространен-

ными  последовательностями  нуклеотидов  в  G-боксе  про-

моторов были CCACGTGG, а в С-боксе - TGACGTCA [Niu 
et al., 1999].

Вирус табачной мозаики и салициловая кислота вызы-

вали у растений табака индукцию двух генов факторов ре-

гуляции  транскрипции  класса  WRKY,  узнающих  в  промо-

торных  участках защитных генов определенную последова-

тельность нуклеотидов - TTGAC (W-box). Активация этих 

факторов регуляции транскрипции осуществлялась с помо-

щью их фосфорилирования протеинкиназами [Chen,  Chen, 

2000]. Все белки класса WRKY, в отличие от других классов 

транскрипционных факторов (таких, как bZIP и myb), име-

ют  консервативный  домен,  содержащий  гептамерный  пеп-

тид WRKYGQK [Rushton, Somssich, 1998].

(

Один  из  доменов  фактора  регуляции  транскрипции,  от-

вечающего  за  преобразование  жасмонатного  сигнала,  акти-

вирует  регуляторный участок промотора нескольких генов, 

кодирующих  жасмонат-  и  элиситор-индуцируемые  белки,  в 

частности  стриктозидин-синтазу  [Van  der  Fits,  Memelink, 

2001].  Оказалось,  что  активирующим  действием  обладает 
N-

концевой  кислый  домен  фактора  регуляции  транскрип-

ции, а обогащенный остатками серина С-концевой домен -I 

ингибирующим.

Показано,  что  промотор  гена  фенилаланин-аммиак-лиа-

зы (важнейшего стартового фермента разветвленного ме-

таболического процесса синтеза соединений, играющих за-

щитную роль, - салицилата, фенольных кислот, фенилпро-

паноидных фитоалексинов и лигнина) содержит по две ко-

пии обогащенных АС-повторами  участков [Gray-Mitsumune 
ctal., 1999].

При изучении промотора гена другого фермента синте-

ia 

фитоалексинов - халконсинтазы, у культуры клеток бо-

бов, табака и риса было обнаружено, что в активации про-

мотора принимают участие G-бокс (CACGTG) в области от 
-

74 до -69 пар нуклеотидов и Н-боксы (ССТАСС) в области 

от -61 до -56 и от -126 до -121 пар нуклеотидов [Arias et al., 
1993].

В других опытах было выяснено, что при действии эли-

ситоров  экспрессия  гена  халконсинтазы  у  растений  гороха 

зависит от области промотора от -242 до -182 пар нуклео-

тидов, в которой два участка содержат идентичные AT по-

следовательности  -ТААААТАСТ-,  причем  одна  из  них, 

располагающаяся в области от -242 до -226, была необхо-

дима для проявления максимальной активности гена [Seki et 
al., 1996].

Промотор  гена  стриктозидин-синтазы,  одного из  клю-

чевых  элиситориндуцируемых  ферментов  синтеза  терпе-

ноидных  фитоалексинов,  имеет  активируемую  факторами 

регуляции транскрипции область от -339 до -145 пар нук-

леотидов  [Memelink  et  al.,  1999].  G-бокс,  расположенный 

вблизи  -105  пары  нуклеотидов,  не  влиял  на  активность 

промотора.

При  исследовании  активности  гена  |3-1,3-глюканазы  у 

растений табака было обнаружено, что она зависит от об-

ласти промотора от -250 до -217 пар нуклеотидов, содержа-

щей последовательность -GGCGGC-, характерную для про-

моторов  генов,  кодирующих  патогениндуцируемые  щелоч-

ные белки [Alonso et al., 1995].

Так  называемый  PR-бокс  промоторных  участков  мно-

гих  патогениндуцируемых  белков  содержит  последователь-

ность  (5'-AGCCGCC-3'),  с  которой  связываются  соответст-

вующие факторы регуляции транскрипции, что приводит к 

экспрессии  генов  этих  белков,  в  частности  эндохитиназ  и 

Р-1,3-глюканаз у растений томатов [Jia, Martin, 1999].

Многие гены патогениндуцируемых белков содержат в 

промоторах  так  называемые  ocs-элементы,  с  которыми 

взаимодействуют факторы регуляции транскрипции, имею-

щие  в  своей  структуре  лейциновые  застежки-молнии. 

У  растений  арабидопсиса  факторы  регуляции  транскрип-

ции, ответственные за преобразование этиленового сигна-

ла, связываются и с GCC-боксом и с ocs-элементами промо-

торов,  что  приводит  к  экспрессии  целого  ряда  защитных 

белков [Buttner, Singh, 1997].

Исследование  трансгенных  растений  табака  с  промото-

ром щелочной хитиназы и репортерным геном GUS позво-

лило  установить, что активируемая этиленовым  сигналом 

область промотора находится между -503 и -358 парами ну-

клеотидов,  где  имеются  две  копии  GCC-бокса  (5'-
TAAGAGCCGCC-3') [Shinshi et al., 19

95], который характе-

рен  для  промоторов  многих  этилениндуцируемых  белков. 

Дальнейший  анализ  показал,  что  ответственный  за  реак-

цию на этилен участок промотора с двумя копиями GCC-бо-

кса расположен между -480 и —410 парами нуклеотидов.

При исследовании реакции растений табака на обработ-

ку этиленом и инфицирование вирусом мозаики было обна-

ружено,  что  активность  промотора  гена  (3-1,3-глюканазы 

зависит от области, расположенной между -1452 и -1193 па-

рами нуклеотидов, где имеются две копии гептануклеотида 
5-AGCCGCC-3' [Vogeli-Lange et al., 

1994]. Найдены и допол-

нительные  области,  существенные  для  регуляции  актив-

ности промотора.

Рассмотренные  выше  элиситоры,  рецепторы  элисито-

ров,  G-белки,  протеинкиназы,  протеинфосфатазы,  факторы 

регуляции  транскрипции,  соответствующие  им  промотор-

ные участки генов принимают участие в функционировании 

целого ряда сигнальных систем клеток, от которых зависит 

их  реакция на  сигналы  различной природы  и интенсивно-

сти:  аденилатциклазной,  МАР-киназной,  фосфатидатной, 

кальциевой, липоксигеназной, НАДФН-оксидазной, NO-

синтазной и протонной.

АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНАЯ СИГНАЛЬНАЯ СИСТЕМА

Эта сигнальная система получила свое название по впер-

вые  охарактеризованному  Сазерлендом  [Sutherland,  1962] 

ферменту  аденилатциклазе,  катализирующей  образование 

основного  сигнального  интермедиата  этой  системы  -  цик-

лического  аденозинмонофосфата  (цАМФ).  Схема  адени-

латциклазной системы такова: внешний химический сигнал, 

например гормон или элиситор, взаимодействует с белком-

рецептором плазмалеммы, что приводит к активации G-

белка  (связывания  им  ГТФ)  и  передаче  сигнального 

импульса  на  фермент  аденилатциклазу  (АЦ),  который  ка-

тализирует синтез цАМФ из АТФ (рис. 6).

В аденилатциклазной системе различают Gs-белки, сти-

мулирующие аденилатциклазу, и (5,-белки, тормозящие ак-

тивность  фермента.  Различия  между  этими  двумя  видами 

белков  определяются  в  основном  особенностями  ос-субъ-

единиц,  а  не  (3-  и  у-субъединиц.  Молекулярные  массы  oc

s

-

субъединиц  G-белка  равны  41-46  кДа,  а

г

субъединиц  -

40-

41 кДа, (3,- и Р

2

-

субъединиц - 36-35 кДа, у-субъединиц -8-

10 кДа. Связывание G-белками ГТФ и его гидролиз до ГДФ и 

неорганического  ортофосфата  обеспечивают  обратимость 

процессов активации аденилатциклазы [Gilman, 1987].

Аденилатциклаза  является  мономерным  интегральным 

белком плазматической мембраны и поэтому с трудом под-

дается экстракции и переходу в растворимую форму. Моле-

кулярная  масса  аденилатциклазы  клеток  животных  равна 
120-

155  кДа;  имеются  также  растворимые  формы  адени-

латциклазы 50-70 кДа, не чувствительные к кальмодулину 

и G-белкам [Ichikawa et al., 1997]. У растений молекулярная 

масса аденилатциклазы составляет 84 кДа. Кривая зависи-

мости активности аденилатциклазы от рН имела одновер-

шинный характер, причем пик активности для этого фер-