Файл: Сигнальные системы клеток растений.pdf

мента находился в области рН 4,8-5,2 [Carricarte et al., 1988]. 

Получены данные об изоформе аденилатциклазы с оптиму-

мом рН, равным 8,8 [Simonin et al., 1988].

Аденилатциклаза  может  модифицироваться  с  внешней 

стороны  мембраны  гликозилированием,  а  с  внутренней  -

фосфорилированием  А-киназой  [Северин,  1991].  Актив-

ность  мембранной  аденилатциклазы  зависит  от  фосфоли-

пидного окружения - соотношения фосфатидилхолина, фо-

сфатидил-этаноламина,  сфингомиелина,  фосфатидилс'ери-

на и фосфатидилинозитола.

Содержание  цАМФ  в  клетках  определяется  соотноше-

нием  активности  двух  ферментов  -  аденилатциклазы  и 

фосфодиэстеразы 3',5'-цАМФ  (ФДЭ).  При действии послед-

ней фосфодиэфирная связь цАМФ подвергается гидролизу, 

что приводит к появлению неактивного нециклического 5'-

АМФ.

Элиситориндуцируемое повышение содержания цАМФ 

в клетках имеет преходящий характер, что объясняется ак-

тивацией ФДЭ и, возможно, связыванием цАМФ-зависимы-

ми  протеинкиназами.  Действительно,  повышение  концент-

рации цАМФ в клетках активирует различные цАМФ-зави-

симые  протеинкиназы,  которые  могут  фосфорилировать 

различные  белки,  в  том  числе  факторы  регуляции  транс-

крипции, что приводит к экспрессии различных генов и от-

вету клетки на внешнее воздействие.

Коэффициент умножения сигнала, достигаемый при его 

передаче в геном и экспрессии генов, составляет многие ты-

сячи.  Схема  умножения  сигнала  при  функционировании 

аденилатциклазной сигнальной системы часто используется 

в учебниках биохимии [Lehninger et al., 1993]. Эта сигналь-

ная система продолжает интенсивно исследоваться на раз-

личных  объектах,  пополняя  представления  об  информаци-

онном поле клеток и его связи с внешними информацион-

ными потоками.

Необходимо заметить, что вопрос о функционировании 

аденилатциклазной  сигнальной  системы  в  растительных 

объектах  на  протяжении  почти  четверти  века  продолжал 

оставаться дискуссионным, разделяя исследователей на ее

Рис. 6. Схема функционирования аденилатциклазной сигнальной 

системы

АЦ* - активная форма аденилатциклазы; ПКА и ПКА* - неактив-

ная и активная формы протеинкиназы А; ПЛ - плазмалемма; ФДЭ -

фосфодиэстераза; ФРТ* - активная форма фактора регуляции транс-

крипции

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ

сторонников  [Доман,  Феденко,  1976;  Королев,  Выскребен-

цева, 1978; Franco, 1983; Яворская, Калинин, 1984; Newton, 
Brown, 

1986; Каримова, 1994, Assman, 1995; Trewavas, Malho, 

1997;  Trewavas, 

1999;  и  др.]  и  противников  [Keates,  1973; 

Varner,  1975;  Amrhein,  1977;  Letham,  1987;  Hahn, 
Grisebach,1983; Spiteri et al., 

1989; и др.]. Первые опирались 

на данные о повышении активности аденилатциклазы и со-

держания цАМФ под действием фитогормонов и патогенов, 

об имитации экзогенным цАМФ действия различных фито-

гормонов,  вторые  -  на  факты,  свидетельствовавшие  о  не-

значительном содержании цАМФ в растениях, об отсутст-

вии в целом ряде опытов влияния фитогормонов на актив-

ность аденилатциклазы и т.д.

Успехи  в  области  молекулярной  генетики,  сопоставле-

ние  структуры  генов  белков-участников  аденилатциклаз-

ной сигнальной системы  у  животных и растений склонили 

чашу  весов  в  пользу  сторонников  ее  функционирования  у 

растений [Trewavas, Malho, 1997; Trewavas, 1999]. Результа-

ты  использования  экзогенного  цАМФ  [Килев,  Чекуров, 

1977]  или  форсколина  (активатора  аденилатциклазы) 
[Ichikawa et al., 

1997] свидетельствовали об участии цАМФ в 

сигналиндуцированнои  цепи  передачи  сигнала.  Применение 

теофиллина  -  ингибитора  фосфодиэстеразы  цАМФ,  кото-

рая в растениях оказалась достаточно активной, показало, 

что приходная часть баланса цАМФ осуществляется доста-

точно  интенсивно  [Яворская,  1990;  Каримова  и  др.,  1990]. 

Были получены данные об изменении содержания цАМФ в 

растениях под влиянием патогенов [Tu, Malhotra, 1977], его 

необходимости для формирования ответа на действие пато-

генов [Зарубина и др., 1979; Очеретина и др., 1990].

Обращает на себя внимание факт АТФ-зависимого вы-

деления во внеклеточную среду значительной части цАМФ, 

образованного  в  клетках  животных  [Makman, 
Sutherland,1965; 

Федоров и др., 1990; Fehr et al., 1990; Орлов, 

Максимова,  1999],  прокариот  [Goldenbaum,  Hall,  1979;  Ши-

ян, Лазарева, 1988], водорослей [Franco, 1983] и высших рас-

тений [Ashton, Polya, 1977; 1978; Каримова и др., 1993]. По-

казательно, что у растений, так же как у животных, можно 

было снизить накопление цАМФ в клетках и выход его во 

внеклеточную среду с помощью простагландина [Ehsan et 
al., 

1998; 1999], не обнаруживаемого в растениях. Возмож-

но,  что  эту  роль  выполняет  аналогичный  простагландину 

оксилипин  -  жасмонат.  Предполагается  возможность  уча-

стия в выносе цАМФ из клетки специальных АТФ-связыва-

ющих белков [Fehr et al., 1990].

Целесообразность секреции цАМФ из клеток растений 

в среду объясняют, в первую очередь, необходимостью до-

статочно  быстрого  снижения  концентрации  этого  вторич-

ного посредника для того, чтобы не происходило перевоз-

буждения клеток [Franco, 1983; Каримова и др., 1993]. Отно-

сительно быстрое  снижение концентраций вторичных по-

средников после достижения максимального уровня являет-

ся непременнной неспецифической чертой функционирова-

ния всех сигнальных систем.

Вероятно,  выводимый  за  пределы  плазмалеммы  цАМФ 

принимает  участие  в  регуляции  внеклеточных  процессов 

[Шиян, Лазарева, 1988]. Это мнение может основываться на 

обнаружении  экто-цАМФ-зависимых  протеинкиназ  [Kang 
et  al., 

1979], использующих секрецию цАМФ из клеток для 

активирования  фосфорилирования  белков  за  пределами 

плазмалеммы. Полагают также, что цАМФ вне клетки мо-

жет  выполнять  роль  первого  посредника  [Федоров  и  др., 

1990],  индуцируя  запуск  каскада  реакций  сигнальных  сис-

тем в соседних клетках, что было показано на примере мно-

гоклеточных слизевых грибов [Sucgang et al., 1997].

Привлекают внимание данные, полученные на животных 

объектах, об ингибировании экзогенным  аденозином  (кото-

рый может рассматриваться в качестве продукта деградации 

цАМФ) кальциевых каналов клеток [Меерсон, 1986] и акти-

вировании - калиевых каналов [Орлов, Максимова, 1999].

Большой  интерес  вызывает  информация  о  возможности 

регуляции  секретируемым  цАМФ  развития  патогенных  гри-

бов [Knogge, 1998], в частности ржавчины ячменя [Kinane et 
al., 2000], Magnaporthe grisea, 

поражающего растения риса [Xu, 

Hamer, 1996; Choi, Dean, 1997; Adachi, Hamer, 

1998], пыльной 

головни Ustilago maydis [Gold et al., 1997; Kahmann et al., 1999], 
Erysiphe  graminis  [A.A.  Hall  et  al.,  1999],  Colletotrichum  trifolii 
[Yang,  Dickman, 

1999],  пигментирования  Ustilago  hordei 

[Lichter, Mills, 

1998]. В зависимости от концентрации цАМФ 

происходила  стимуляция  или  подавление  развития  грибов. 

Полагают, что у них в трансдукции цАМФ-сигнала принима-

ют участие гетеротримерные G-белки [Bolker, 1998].

Накапливается все больше данных о влиянии различных 

сигнальных  молекул  на  секрецию  цАМФ  растительными 

клетками.  Было  показано,  что  роль  АБК  в  адаптации 

растений к стрессу может заключаться в ее способности ре-

гулировать содержание и выход цАМФ из клеток. Предпо-

лагается, что  уменьшение содержания цАМФ при действии 

АБК  вызвана  АБК-индуцированным  повышением  содер-

жания Са

2+

в цитозоле [Iagoucheva et al., 2000] и ингибирова-

нием  аденилатциклазы.  Известно,  что  Са

2+

в  высокой  кон-

центрации ингибирует активность аденилатциклазы у эука-

риот  [Taussig,  Gilman,  1995].  В  то  же  время  Са

2+

может 

уменьшить  содержание  цАМФ,  индуцируя  повышение  ак-

тивности  фосфодиэстеразы,  гидролизующей  цАМФ.  Дейст-

вительно,  активация  фосфодиэстеразы  цАМФ  комплексом 

Са

2+

-

кальмодулин  была  обнаружена  у  растительных  объек-

тов [Феденко, 1983].

Показана  зависимость  профиля  фосфорилированности 

полипептидов от экзогенного цАМФ. Число полипептидов, 

фосфорилирование  которых  стимулировалось  цАМФ,  бы-

ло  наибольшим  при  микромолярной  концентрации  цАМФ. 

Привлекает  внимание  факт  сильного  цАМФ-индуцирован-

ного  повышения  фосфорилированности  полипептида 
1

0 кДа при низкой температуре (рис. 7) [Каримова, Жуков, 

1991;  Ягушева,  2000].  Интересно,  что  полипептид  с  такой 

молекулярной  массой  является  белковым  регулятором  фо-

сфодиэстеразы  цАМФ,  который  активируется  абсцизовой 

кислотой и Са

2+

  [Junker, 

1977] и снижает содержание цАМФ 

за счет его гидролиза фосфодиэстеразой.

Изучение  особенностей  активации  цАМФ-зависимых 

протеинкиназ  и  фосфорилирования  ими  различных  бел-

ков - одно из важнейших направлений исследований аде-

нилатциклазной  сигнальной  системы.  цАМФ-зависимые 

протеинкиназы  (ПКА)  -  это  ферменты,  активирующиеся 

при взаимодействии с цАМФ и катализирующие перенос 

концевого остатка фосфорной кислоты с АТФ на гидро-

ксильные  группы  сериновых  или  треониновых  остатков 

белков-акцепторов.  Ковалентная  модификация  белков, 

осуществляемая  при  фосфорилировании,  приводит  к  из-

менению  их  конформации  и  каталитической  активности, 

вызывая ассоциацию или диссоциацию их субъединиц 

и т.д.

Молекулярная масса белков, кДа

Рис. 7. Влияние цАМФ на фосфорилирование белков трехднев-

ных проростков гороха [Каримова, Жуков, 1991]

1 - 

контроль: срезанные побеги переносили на 2 ч черешками в во-

ду, затем еще на 2 ч - в раствор меченного по 

32

Р ортофосфата; 2 - сре-

занные растения переносили на 2 ч в раствор 1 мкМ цАМФ, затем еще 

на 2 ч - в раствор меченного по 

32

Р ортофосфата 

Субстратами в протеинкиназной реакции являются Mg-

АТФ и фосфорилируемый белок. Белковые субстраты мо-

гут быть одновременно субстратами для цГМФ- и цАМФ-

зависимых протеинкиназ по одним и тем же остаткам сери-

на  (треонина),  но  скорость  цАМФ-зависимого  фосфорили-

рования в 10-15 раз больше, чем у цГМФ-зависимых протеин-

киназ [Cohen, 1980]. Субстраты цАМФ-зависимых протеин-

киназ располагаются во всех частях клетки: цитозоле, эндо-

плазматическом ретикулуме (ЭПР), аппарате Гольджи, сек-

реторных гранулах, цитоскелете и ядре.

Из  клеток  растений  были  выделены  протеинкиназы, 

активируемые  экзогенным  цАМФ,  например,  из  колеоп-

тилей  кукурузы  -  протеинкиназа  36  кДа  [Janistyn,  1986; 

1988]. Като и соавт. [Kato et al.,  1983] выделили из ряски 
Lemna  paucicostata 

три  типа  протеинкиназ:  165,  85  и 

145 кДа, одна из которых ингибировалась цАМФ, другая ак-

тивировалась цАМФ и третья была цАМФ-независимой.

Второй  тип  протеинкиназ  фосфорилировал  полипептиды 

59, 19, 16 и 14 кДа.

Экзогенный цАМФ вызывал изменения (в основном, ин-

гибирование)  фосфорилирования  ряда  полипептидов  хло-

ропластов,  опосредованного  участием  протеинкиназ 
[Khurana et al, 1996].

Один из первых генов протеинкиназы, клонированных в 

растениях, был похож на семейство протеинкиназ А живот-

ных  по  последовательностям  нуклеотидов  [Lowton  et  al., 

1989]. Имеются примеры сходства аминокислотных последо-

вательностей протеинкиназ А из растений (их гомологию) с 

протеинкиназами А животных. Несколько групп исследова-

телей  сообщили  о  клонировании  генов,  гомологичных  гену 

протеинкиназы  А  (обзорные  работы:  [Assman,  1995;  Stone, 
Walker, 

1995]).  Протеинкиназа из петунии фосфорилировала 

специфичный  синтетический  субстрат  протеинкиназы  А 
[Polya,  Bovman, 

1991].  Сообщалось  о  том,  что  добавление 

цАМФ  к  экстрактам  растений  стимулирует  фосфорилирова-

ние специфичных белков [Assman, 1995]. Исследование мест 

фосфорилирования  в  фенилаланин-аммиак-лиазе  (ФАЛ)  -

ключевом  ферменте  биосинтеза  фитоалексинов,  обнаружило 

сайты, специфичные для протеинкиназы A [Bolwell, 1995].

Использование  высокоспецифичного  белкового  инги-

битора (БИ) цАМФ-зависимых протеинкиназ [Walsh et al., 

1971]  позволило  подтвердить  предположение  [Newton, 
Brown, 

1986], что цАМФ-зависимые протеинкиназы могут 

быть  активированы  эндогенным  цАМФ  еще  в  процессе 

приготовления  образца:  БИ  подавлял  базальную  протеин-

киназную активность экстрактов из листьев в разных опы-

тах на 30-50% [Каримова, 1994]. Интермедиаты липоксиге-

назной сигнальной системы ГДК и МеЖК активировали в 

присутствии цАМФ протеинкиназную активность на 33-

^8%  [Каримова  и  др.,  19996].  Салициловая  кислота  инду-

цировала  повышение  уровня  цАМФ-зависимой  фосфори-

лированности полипептидов 74, 61 и 22 кДа в листьях горо-

ха  [Мухаметчина,  2000].  цАМФ-стимулируемая  протеинки-

назная  активность  растворимых  белков  листьев  гороха  за-

висела  от  концентрации  Са

2+

[Каримова  и  др.,  1989;  Тар-

чевская, 1990; Каримова, Жуков, 1991], причем фермента-

тивная активность обнаруживалась также в изолированных 

клеточных стенках, ядрах, плазматических мембранах.

В растениях найдены гены, кодирующие фермент про-

теинфосфатазу, мишенью которой являются белки, фосфо-

рилированные с помощью протеинкиназы А.

Для характеристики аденилатциклазной сигнальной сис-

темы  чрезвычайно  важен  факт  обнаружения  в  растениях 

генов,  кодирующих  белковые  факторы  регуляции  транс-

крипции,  которые  имеют  протяженные  последовательно-

сти нуклеотидов, гомологичные CREB

S

  - 

цАМФ-связываю-

щему фактору транскрипции у животных [Bolwell, 1995].

Многочисленные  данные  о  влиянии  цАМФ  на  ионные 

каналы  клеток  растений  и  относительно  слабая  экспери-

ментальная  база  представлений  о  возможности  передачи 

сигналов от цАМФ через фосфорилирование белковых фа-

кторов регуляции транскрипции в геном, с одной стороны, 

укрепляют позиции сторонников существования непрямого 

(через  активацию ионных  каналов)  сигнального  аденилат-

циклазного пути и, с другой, заставляют усилить попытки 

получения  доказательств  функционирования  прямого 

цАМФ-сигнального пути.

МАР-КИНАЗНАЯ СИГНАЛЬНАЯ СИСТЕМА

Митогенактивируемые  серин-треонинового  типа  про-

теинкиназы  (МАРК)  и  МАР-киназный  сигнальный каскад 

(сигнал —> рецептор —>  G-белки —> МАРККК —» 
—

> МАРКК —> МАРК —> ФРТ —> геном), достаточно полно 

изученные  в  животных  объектах,  функционируют  и  в 

клетках растений (рис. 8). Им посвящены обзорные статьи 
[Kultz,  1998;  Jonak  et  al.,  1999;  Jouannic  et  al., 1999b; 
Meskiene,  Hirt, 

2000]  и  работы  экспериментального  харак-

тера, в которых сообщаются сведения об индивидуальных 

представителях  этой  сигнальной  системы  [Ichimura  et  al., 
1998; Nishihama et al.,  1997; Jouannic  et al., 1999b] 

и особен-

ностях их регуляции.

МАР-киназный каскад "включается" при митозе (чем и 

объясняется название этих протеинкиназ), при обезвожива-

нии [Mizoguchi et al., 1996; Тепа, Renaudin, 1998], гипоосмо-

тическом  стрессе  [Cazale  et  al.,  1998],  низкой  температуре 
[Jouannic et al., 1999b], 

механическом раздражении растений 

[Mizoguchi et al., 

1996], повреждении тканей [Seo et al., 1995; 

Bogre et al., 1997; Morris et al., 

1997], окислительном стрессе 

[Kovtun  et  al., 

2000],  действии  патогенов  [Zhang,  Klessig, 

1998a;  Meskiene,  Hirt, 

2000],  элиситоров  [Suzuki,  Shinshi, 

1995;  Ligterink  et  al.,  1997;  Kultz,  1998;  Zhang  et  al.,1998] 

(в 

том числе харпинов [Adam et al., 1997], криптогеина [Lebrun-
Garcia, 

1998], олигосахаридов [Zhang  et  al., 1998]),  стрессо-

вых фитогормонов жасмоната [Seo et al., 1995; 1999], сали-

цилата [Zang, Klessig, 1997; 1998], системина [Meindl et al., 

1998], этилена [Meskiene, Hirt, 2000]).

Зависимость  функционирования  МАР-киназного  каска-

да от различных воздействий нашла отражение в названиях 

некоторых МАР-киназ, например WIPK и SIPK (соответст-

венно wound-induced protein kinases и salicylate-induced protein

Рис. 8. Схема функционирования МАР-киназной сигнальной си-

стемы

ККМАРК  -  киназа  киназы  МАР-киназы;  КМАРК  -  киназа МАР-

киназы;  МАРК  -  митогенактивируемая  протеинкиназа.  Остальные 

обозначения - см. рис. 6