ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 01.12.2019
Просмотров: 3457
Скачиваний: 3
носят к расонеспецифичным элиситорам, вызывающим неспецифичные защитные ответы со стороны инфицируемых растений. Это вполне объяснимо, так как в ходе деградации полисахаридов образуется широкий спектр олигосахаридов, у которых очень слабо выражена видовая специфика патогена или хозяина. В то же время расо-специфичными являются белковые (или пептидные) факторы вирулентности бактерий, которые узнаются "своими" рецепторами клеток растений [Blumwald et al., 1998]. Последний тип взаимодействия получил название генетического пинг-понга, или взаимодействия "ген-на-ген", поскольку специфика элиситора или рецептора определяется кодирующими их генами, а устойчивость или восприимчивость растений к патогену - способностью рецептора узнавать элиситор.
Для исследования механизмов ответа клеток растений на действие элиситоров часто используют не индивидуальные олигосахариды, а смесь олигосахаридов, образующуюся при гидролизе полисахаридов клеточных стенок патогенных грибов [Ayres et al., 1976; Shirasugi, Misaki, 1992; и др.]. Такой подход оправдан, если учесть, что даже в первые моменты инфицирования патогенами на клетки растений может действовать не один, а несколько элиситоров. Кстати, имеется сравнительно мало работ, посвященных исследованию особенностей действия нескольких элиситоров одновременно. Например, показано, что элиситины параситице-ин и криптогеин, так же как олигосахаридные элиситоры из клеточных стенок, вызывают быструю активацию проте-инкиназы 48 кДа SIP-типа и фенилаланинаммоний-лиазы у табака. В то же время именно элиситины, а не олигосахариды активировали протеинкиназу 40 кДа [Zhang et al., 1998]. Глюкан и Са2+ усиливали влияние арахидоната и эйкозапен-таеноата. Тот факт, что ЭГТА (специфический лиганд Са2+) ингибировал синтез фитоалексинов, дает возможность утверждать, что ионы кальция играют важную роль в регуляции осуществления защитной функции растений. Не исключено, что сигнальными веществами являются и продукты деградации белков клеточных стенок, богатых оксипроли-новыми остатками и содержащих олигогликозильные ответвления.
РЕЦЕПТОРЫ ЭЛИСИТОРОВ
Во введении уже упоминалось, что рецепторы элиситорных сигналов могут располагаться и в клеточной мембране, и в цитозоле, и в ядре, но нас особенно интересует первый, наиболее распространенный случай, когда элиситор сам не проникает в клетку, а взаимодействует с внеклеточной частью белкового рецептора плазмалеммы, что и является первым звеном сложной цепи сигнальных событий, завершающихся ответом клетки на изменившиеся условия существования. Количество молекулярных антенн одного вида рецепторов плазмалеммы клетки, по-видимому, может достигать нескольких тысяч. Число видов молекулярных антенн остается неизвестным, но можно утверждать, что у них унифицированы основные свойства структуры. Они имеют три основных домена: внешний вариабельный N-концевой домен (акцепторный по отношению к элиситорам), трансмембранный с повышенным содержанием гидрофобной аминокислоты лейцина и цитоплазматический вариабельный С-концевой домен, от структуры которого чависит передача сигнального импульса в ту или иную сигнальную систему. Рецептор может быть специфичным только для одного вида элиситора или для группы родственных (например, олигомерных) элиситоров. Описано несколько типов рецепторных белков клеточных мембран у животных [Schenk, Snaar-Jagalska, 1999]: у одних рецепторов трансмембранная цепь белка лишь один раз пересекает мембрану, у других (серпентиновых) - семь раз, у третьих изаимодействие с лигандом-элиситором приводит к образованию гомо- или гетеродимера (олигомера), который и является первичным преобразователем внешнего сигнала. Структура рецепторных белков плазмалеммы растений изучена в меньшей степени, но принципы их построения те
АТФ
АТФ
Рис.
4. Схема структуры двухкомпонентного
рецептора сигнальных
систем [Lohrmann,
Harter,
2002]
а - простой рецептор; б — многозвенный рецептор. 1 - "входной" домен; 2 - автокиназный гистидиновый домен; 3 - воспринимающий домен регулятора ответа; 4 - "выходной" домен регулятора ответа; 5 - гисти-динсодержащий фосфатпереносящий домен; А - остаток аспарагиновой кислоты; Г - остаток гистидина; Р - остаток ортофосфата, переносимый в ходе киназных реакций. Внешний сигнал обозначен в виде символа молнии
же, что и у животных клеток. Привлекает особое внимание двухкомпонентная рецепторная структура, обладающая свойствами протеинкиназы (рис. 4). Сначала она была обнаружена у прокариотических организмов, а затем в измененном виде - и у эукариотических организмов, в том числе у растений, например у арабидопсиса [Loomis et al., 1997]. Если в первом случае два компонента - собственно рецепторный и исполнительный - представляют собой самостоятельные, хотя и взаимодействующие, белковые молекулы, то во втором - это два домена одного и того же белка.
Подтверждением роли взаимодействия элиситор-рецептор в передаче и преобразовании сигналов от патогенов в геном было установление положительной корреляции между способностью элиситоров нековалентно соединяться с рецепторами и вызывать защитную реакцию клеток, например накопление фитоалексинов [De Wit et al., 1997]. Связывание с внешним участком белковых рецепторов плазмалеммы [Hang et al., 1994; Проценко, 1995; Mithofer et al.,
1996; Nennstiel et al., 1998] было характерным для олигоса-харидных элиситоров клеточных стенок растений [Cosio et al., 1990; Klusener, Weiler, 1999], олигохитиновых фрагментов клеточных стенок грибов [Baureithel et al., 1994; Y. Ito et al., 1997], элиситорных белков [Nurnberger et al., 1994; Wendehenne et al., 1995; De Wit et al., 1997; Kamoun et al., 1998; Lauge, De Wit, 1998; Warren et al., 1998; Lebrun-Garcia et al., 1999] и пептидов [Kooman-Gersmann et al., 1998; Nennstiel et al., 1998], сиринголидов [Ji et al., 1998], стрессовых фито-гормонов системина [Schaller, Oecking, 1999], этилена [Savaldi-Goldstein, Fluhr, 2000; и др.], абсцизовой кислоты [Anderson et al., 1994; MacRobbie et al., 1997; Адамовская и др., 2000; Munnik, 2001], метилжасмоната [Lobler, Lee, 1998], брассиностероидов [Braun, Walker, 1996; Li, Chory, 1997]. В последнем случае имеется принципиальное отличие от клеток животных, у которых рецепторы стероидных гормонов находятся в ядре.
Выделен целый ряд мембранных белковых рецепторов элиситоров. Для этого после связывания рецепторами меченых элиситоров мембраны выделяются из клеток, разрушаются и белок с удерживаемым элиситором идентифицируется по его радиоактивности. Обнаружено, например, что рецептором системина является белок 160 к Да [Meindl et al., 1998], бактериального элиситора флагеллина - мембранный белок 115 кДа [Meindl et al., 2000], гликопротеина из клеточной стенки фитофторы, имеющего сигнальный оли-гопептидный фрагмент из 13 остатков аминокислот -91 кДа [Nurnberger et al., 1997] или 100 кДа [Nennstiel et al., 1998].
Концепция молекулярного взаимодействия "ген-на-ген" [Flor, 1971] патогенов и растений часто предполагает непрямое (опосредованное сигнальными системами) узнавание гена авирулентности патогена (avr gene) соответствующим ему геном устойчивости (R gene) растительной клетки.
Молекулярной основой "ген-на-ген" взаимодействия патогена и растения явилась модель элиситор-рецептор [Gabriel, Rolfe, 1990]. Рецепторные белки были выделены и очищены [Mithofer et al., 1996], а гены, кодирующие эти белки, клонированы [Umemoto et al., 1997]. Имеется ряд обзорных работ, посвященных структуре рецепторных белков
[Bent, 1996; Backer et al., 1997; Hammond-Kosack, Jones, 1997]. Оказалось, что многие из них имеют сходные консервативные обогащенные лейцином повторы (от 12 до 21), необходимые для белок-белкового взаимодействия. Эти повторы обеспечивают связывание рецепторного R-белка с элиситорами [Bent, 1996]. Исследования мутантов с нарушенной устойчивостью к патогенным бактериям, вызванной замещением глутамата на лизин в одном из лейциновых повторов, подтверждают, что межбелковое взаимодействие является важным звеном преобразования и передачи элиситорных сигналов в геном клетки [Warren etal., 1998].
В настоящее время принято несколько моделей структуры рецепторов и способов передачи элиситорного сигнала снаружи внутрь клетки растения. У арабидопсиса обнаружено семейство из 35 серпентиновых рецепторов [Devoto et al., 1999]. Рецептор воспринимает сигнальную молекулу N-терминальным участком на внешней стороне мембраны, а передает сигнальный импульс в цитоплазму внутренним С-участком. Связывание сигнальной молекулы приводит к изменению конформации всей молекулы рецептора, что обусловливает активацию ассоциированных с ним в цитоплазме белковых молекул, осуществляющих преобразование сигнала.
Одним из принципиально важных механизмов, используемых в сигнальных системах клеток, является димериза-ция (олигомеризация) некоторых белковых интермедиатов этих систем [Heldin, 1995]. В качестве примеров можно привести димеризацию рецепторов после связывания с ними лигандов, димеризацию некоторых интермедиатов сигнальных систем, димеризацию факторов регуляции транскрипции. Наблюдается как гомо-, так и гетеродимеризация (олигомеризация). У животных механизм димеризации тирозин-киназных рецепторов клеточной мембраны характерен, например, для трансдукции полипептидных гормонов (ростовой фактор плаценты и др). Серин/трео-нин-киназные рецепторы функционируют подобным же образом. Мало известно о том, какие формы рецепторов -мономерные, гомодимерные или гетеродимерные - принимают участие в преобразовании элиситорных сигналов в клетках растений. Предложена схема гетеродимерного ре-
цептора [Trotochaud et al., 1999], который активируется ли-гандом, что приводит к фосфорилированию цитозольного киназного домена и активации ассоциированных с ним белков, часть из которых передает сигнальный импульс следующим интермедиатам сигнальных систем. Одним из ассоциированных белков является протеинфосфатаза, инактивирующая киназный домен.
У животных клеток тирозин-киназный рецептор состоит из трех доменов - экстраклеточного, трансмембранного и обращенного в цитозоль. Специфика структуры первого и третьего доменов (заключающаяся, например, в том, что они не способны фосфорилироваться) определяет, с одной стороны, с каким гормоном взаимодействует рецептор и, с другой, какие сигнальные системы "включает" этот гормон. Взаимодействие внешнего домена с сигнальным лигандом приводит к автофосфорилированию тирозинового остатка этого домена, что повышает его ки-назную активность. Обычно протеинкиназы содержат несколько мест фосфорилирования. Это относится и к ре-цепторным протеинкиназам. Цитоплазматический домен мономерной формы рецептора фактора роста у животных клеток содержит, по крайней мере, девять автофосфори-лируемых тирозиновых остатков [Heldin, 1995]. Один из них - Тир 857 - важен для проявления киназной активности, а восемь других определяют специфику связи с молекулами, преобразующими сигнал. Есть основания полагать, что те же принципы функционирования рецепторов используются и в клетках растений, однако в них найдены главным образом серин-треониновые рецепторные протеинкиназы, участвующие в патогениндуцированных защитных реакциях растений.
В настоящее время 18 рецепторподобных серин-треони-новых протеинкиназ арабидопсиса подразделяют [Hardie, 1999] в зависимости от структуры их экстраклеточного домена на четыре группы:
1. Протеинкиназы с доменами, обогащенными лейцино-выми повторами, обычно характерными для фрагментов, участвующих в белок-белковых взаимодействиях. У животных такие рецепторы связывают полипептидные (или пептидные) сигнальные молекулы. Предполагают, что к этой группе относятся рецепторы брассинолидов с обогащенны-
ми лейцином повторами в N-концевой надмембранной области [Li, Chory, 1997; Cosgrove et al., 2000]. У томата был выделен ген аналогичного белка, но без цитозольного ки-назного домена [Jones et al., 1994].
2. Протеинкиназы
с S-доменами,
в которых имеется
много
остатков цистеина.
-
Протеинкиназы с доменами, обогащенными лейцино-
выми повторами, но, в отличие от первой группы, связан
ные с лектинами. Это создает возможность рецепции этими
протеинкиназами олигосахаридных элиситоров. -
Протеинкиназы, связанные с клеточной стенкой.
В эти группы не вошли некоторые протеинкиназы, в частности протеинкиназа, имеющая экстраклеточный домен, связывающийся с белком, который накапливается в межклеточном пространстве при инфицировании растений различными патогенами. Как уже отмечалось, многие рецепторные киназы могут взаимодействовать с другими белками, и это обеспечивает как большее разнообразие связываемых химических сигналов, так и регуляцию этих процессов. Возможно, упомянутая протеинкиназа является одним из рецепторных белков, отвечающих за защитные реакции растений.
Одним из древних, консервативных и широко распространенных типов мембранных рецепторов являются трансмембранные автофосфорилирующие гистидинкина-зы [Loomis et al., 1997], способные активироваться широким кругом элиситорных сигнальных молекул. Связывание элиситора внешним, выступающим над липидным слоем плазмалеммы N-концевым участком рецептора вызывает изменение его конформации и автофосфорилирова-ние гистидинового остатка (см. рис. 4). Затем остаток фосфорной кислоты передается на аспартатный остаток внутреннего (цитоплазматического) участка белка [Chang, Meyerowitz, 1995; Hahn, 1996; Chang, Stewart, 1998], что также вызывает изменение его конформации и, вследствие этого, активацию ассоциированного с рецептором фермента (непосредственно или через посредников - чаще всего G-белки). Активация фермента - важнейшее звено сигнальной системы, целью которой является передача и умножение элиситорного сигнала, завершающиеся экспрессией защитных генов и появлением белков, которые
определяют ответ клеток и растения в целом на инфицирование и воздействие элиситоров. Специфичность рецепторов к элиситорам определяется вариабельным внешним N-концом белка, а специфичность к ферменту - его внутренним С-концом. Показано, что этот тип рецепторов взаимодействует со стрессовым фитогормоном этиленом IBleecker et al., 1998; Hua, Meyerowitz, 1998; Theologis, 1998; Woeste, Kieber, 1998; Alonso et al., 1999; Chang, Shockey, 1999; A.E. Hall et al., 1999; Hirayama et al., 1999; Cosgrove et al., 2000; Savaldi-Goldstein, Fluhr, 2000; и др.], который элиситирует защитные реакции клеток растений. Клонирование и определение первичной структуры гена гистидинового рецептора у арабидопсиса показали, что его N-концевой мембранный домен похож на транспортеры ионов металлов [Alonso et al., 1999].
В настоящее время описан трансмембранный рецепторный белок, N-конец которого взаимодействует с клеточной стенкой, а С-конец находится в цитоплазме и обладает свойствами серин-треониновых протеинкиназ [Kohorn et al., 1996]. По мнению авторов, этот рецепторный белок осуществляет сигнальные функции, обеспечивая сигнальный контакт между клеточной стенкой и внутренним содержимым клетки.
Так как взаимодействие сигнальной молекулы и рецептора осуществляется без возникновения между ними ковалентных связей, то нельзя исключить возможности их расстыковки. С другой стороны, ассоциация этих двух типов молекул может быть достаточно прочной, а изменение конформации рецепторного белка создает предпосылки облегчения атаки на него протеаз, распознающих белки с нарушенной структурой и разрушающих эти молекулы. В связи с этим большое значение приобретает способность клеток достаточно быстро восстанавливать численность рецепторов различных типов. Обращают на себя внимание опыты, посвященные изучению влияния ингибиторов синтеза белков на интенсивность связывания элиситоров рецепторными белками плазмалеммы. Оказалось, что обработка клеток циклогексимидом - ингибитором синтеза белков с участием цитоплазматических рибосом, вызывала достаточно быстрое снижение уровня связывания клетками системина, что свидетельствует о вы-
сокой скорости оборота рецепторного белка 160 кда Имеются данные об элиситориндуцированном синтезе рецепторов, располагающихся в плазмалемме [Warren et al 1998], но, насколько известно, в настоящее время все еще отсутствует информация о степени специфичности синтеза того или иного рецепторного белка в зависимости от вида элиситора.
G-БЕЛКИ