Файл: tarchevskiy_i_a_signal_nye_sistemy_kletok_rasteniy.doc

ВУЗ: Не указан

Категория: Не указан

Дисциплина: Не указана

Добавлен: 01.12.2019

Просмотров: 3457

Скачиваний: 3

ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.

носят к расонеспецифичным элиситорам, вызывающим не­специфичные защитные ответы со стороны инфицируемых растений. Это вполне объяснимо, так как в ходе деградации полисахаридов образуется широкий спектр олигосахаридов, у которых очень слабо выражена видовая специфика пато­гена или хозяина. В то же время расо-специфичными явля­ются белковые (или пептидные) факторы вирулентности бактерий, которые узнаются "своими" рецепторами клеток растений [Blumwald et al., 1998]. Последний тип взаимодей­ствия получил название генетического пинг-понга, или вза­имодействия "ген-на-ген", поскольку специфика элиситора или рецептора определяется кодирующими их генами, а ус­тойчивость или восприимчивость растений к патогену - способностью рецептора узнавать элиситор.

Для исследования механизмов ответа клеток растений на действие элиситоров часто используют не индивидуаль­ные олигосахариды, а смесь олигосахаридов, образующую­ся при гидролизе полисахаридов клеточных стенок патоген­ных грибов [Ayres et al., 1976; Shirasugi, Misaki, 1992; и др.]. Такой подход оправдан, если учесть, что даже в первые мо­менты инфицирования патогенами на клетки растений мо­жет действовать не один, а несколько элиситоров. Кстати, имеется сравнительно мало работ, посвященных исследова­нию особенностей действия нескольких элиситоров одно­временно. Например, показано, что элиситины параситице-ин и криптогеин, так же как олигосахаридные элиситоры из клеточных стенок, вызывают быструю активацию проте-инкиназы 48 кДа SIP-типа и фенилаланинаммоний-лиазы у табака. В то же время именно элиситины, а не олигосахари­ды активировали протеинкиназу 40 кДа [Zhang et al., 1998]. Глюкан и Са2+ усиливали влияние арахидоната и эйкозапен-таеноата. Тот факт, что ЭГТА (специфический лиганд Са2+) ингибировал синтез фитоалексинов, дает возможность ут­верждать, что ионы кальция играют важную роль в регуля­ции осуществления защитной функции растений. Не исклю­чено, что сигнальными веществами являются и продукты деградации белков клеточных стенок, богатых оксипроли-новыми остатками и содержащих олигогликозильные от­ветвления.

РЕЦЕПТОРЫ ЭЛИСИТОРОВ

Во введении уже упоминалось, что рецепторы элиситорных сигналов могут располагаться и в клеточной мембране, и в цитозоле, и в ядре, но нас особенно интересует первый, наиболее распространенный случай, когда элиситор сам не проникает в клетку, а взаимодействует с внеклеточной ча­стью белкового рецептора плазмалеммы, что и является первым звеном сложной цепи сигнальных событий, завер­шающихся ответом клетки на изменившиеся условия суще­ствования. Количество молекулярных антенн одного вида рецепторов плазмалеммы клетки, по-видимому, может дос­тигать нескольких тысяч. Число видов молекулярных ан­тенн остается неизвестным, но можно утверждать, что у них унифицированы основные свойства структуры. Они имеют три основных домена: внешний вариабельный N-концевой домен (акцепторный по отношению к элисито­рам), трансмембранный с повышенным содержанием гид­рофобной аминокислоты лейцина и цитоплазматический вариабельный С-концевой домен, от структуры которого чависит передача сигнального импульса в ту или иную сиг­нальную систему. Рецептор может быть специфичным только для одного вида элиситора или для группы родствен­ных (например, олигомерных) элиситоров. Описано не­сколько типов рецепторных белков клеточных мембран у животных [Schenk, Snaar-Jagalska, 1999]: у одних рецепторов трансмембранная цепь белка лишь один раз пересекает мембрану, у других (серпентиновых) - семь раз, у третьих изаимодействие с лигандом-элиситором приводит к образо­ванию гомо- или гетеродимера (олигомера), который и яв­ляется первичным преобразователем внешнего сигнала. Структура рецепторных белков плазмалеммы растений изучена в меньшей степени, но принципы их построения те




АТФ




АТФ


Рис. 4. Схема структуры двухкомпонентного рецептора сигналь­ных систем [Lohrmann, Harter, 2002]

а - простой рецептор; б — многозвенный рецептор. 1 - "входной" до­мен; 2 - автокиназный гистидиновый домен; 3 - воспринимающий домен регулятора ответа; 4 - "выходной" домен регулятора ответа; 5 - гисти-динсодержащий фосфатпереносящий домен; А - остаток аспарагиновой кислоты; Г - остаток гистидина; Р - остаток ортофосфата, переноси­мый в ходе киназных реакций. Внешний сигнал обозначен в виде симво­ла молнии

же, что и у животных клеток. Привлекает особое внимание двухкомпонентная рецепторная структура, обладающая свойствами протеинкиназы (рис. 4). Сначала она была об­наружена у прокариотических организмов, а затем в изме­ненном виде - и у эукариотических организмов, в том числе у растений, например у арабидопсиса [Loomis et al., 1997]. Если в первом случае два компонента - собственно рецепторный и исполнительный - представляют собой самостоя­тельные, хотя и взаимодействующие, белковые молекулы, то во втором - это два домена одного и того же белка.

Подтверждением роли взаимодействия элиситор-рецептор в передаче и преобразовании сигналов от патогенов в геном было установление положительной корреляции меж­ду способностью элиситоров нековалентно соединяться с рецепторами и вызывать защитную реакцию клеток, на­пример накопление фитоалексинов [De Wit et al., 1997]. Свя­зывание с внешним участком белковых рецепторов плазмалеммы [Hang et al., 1994; Проценко, 1995; Mithofer et al.,

1996; Nennstiel et al., 1998] было характерным для олигоса-харидных элиситоров клеточных стенок растений [Cosio et al., 1990; Klusener, Weiler, 1999], олигохитиновых фрагмен­тов клеточных стенок грибов [Baureithel et al., 1994; Y. Ito et al., 1997], элиситорных белков [Nurnberger et al., 1994; Wendehenne et al., 1995; De Wit et al., 1997; Kamoun et al., 1998; Lauge, De Wit, 1998; Warren et al., 1998; Lebrun-Garcia et al., 1999] и пептидов [Kooman-Gersmann et al., 1998; Nennstiel et al., 1998], сиринголидов [Ji et al., 1998], стрессовых фито-гормонов системина [Schaller, Oecking, 1999], этилена [Savaldi-Goldstein, Fluhr, 2000; и др.], абсцизовой кислоты [Anderson et al., 1994; MacRobbie et al., 1997; Адамовская и др., 2000; Munnik, 2001], метилжасмоната [Lobler, Lee, 1998], брассиностероидов [Braun, Walker, 1996; Li, Chory, 1997]. В последнем случае имеется принципиальное отличие от клеток животных, у которых рецепторы стероидных гор­монов находятся в ядре.

Выделен целый ряд мембранных белковых рецепторов элиситоров. Для этого после связывания рецепторами ме­ченых элиситоров мембраны выделяются из клеток, разру­шаются и белок с удерживаемым элиситором идентифици­руется по его радиоактивности. Обнаружено, например, что рецептором системина является белок 160 к Да [Meindl et al., 1998], бактериального элиситора флагеллина - мембран­ный белок 115 кДа [Meindl et al., 2000], гликопротеина из клеточной стенки фитофторы, имеющего сигнальный оли-гопептидный фрагмент из 13 остатков аминокислот -91 кДа [Nurnberger et al., 1997] или 100 кДа [Nennstiel et al., 1998].


Концепция молекулярного взаимодействия "ген-на-ген" [Flor, 1971] патогенов и растений часто предполагает непрямое (опосредованное сигнальными системами) узна­вание гена авирулентности патогена (avr gene) соответст­вующим ему геном устойчивости (R gene) растительной клетки.

Молекулярной основой "ген-на-ген" взаимодействия па­тогена и растения явилась модель элиситор-рецептор [Gabriel, Rolfe, 1990]. Рецепторные белки были выделены и очищены [Mithofer et al., 1996], а гены, кодирующие эти бел­ки, клонированы [Umemoto et al., 1997]. Имеется ряд обзор­ных работ, посвященных структуре рецепторных белков


[Bent, 1996; Backer et al., 1997; Hammond-Kosack, Jones, 1997]. Оказалось, что многие из них имеют сходные кон­сервативные обогащенные лейцином повторы (от 12 до 21), необходимые для белок-белкового взаимодействия. Эти повторы обеспечивают связывание рецепторного R-белка с элиситорами [Bent, 1996]. Исследования мутан­тов с нарушенной устойчивостью к патогенным бактери­ям, вызванной замещением глутамата на лизин в одном из лейциновых повторов, подтверждают, что межбелковое взаимодействие является важным звеном преобразования и передачи элиситорных сигналов в геном клетки [Warren etal., 1998].

В настоящее время принято несколько моделей структу­ры рецепторов и способов передачи элиситорного сигнала снаружи внутрь клетки растения. У арабидопсиса обнару­жено семейство из 35 серпентиновых рецепторов [Devoto et al., 1999]. Рецептор воспринимает сигнальную молекулу N-терминальным участком на внешней стороне мембраны, а передает сигнальный импульс в цитоплазму внутренним С-участком. Связывание сигнальной молекулы приводит к изменению конформации всей молекулы рецептора, что обусловливает активацию ассоциированных с ним в цито­плазме белковых молекул, осуществляющих преобразова­ние сигнала.

Одним из принципиально важных механизмов, исполь­зуемых в сигнальных системах клеток, является димериза-ция (олигомеризация) некоторых белковых интермедиатов этих систем [Heldin, 1995]. В качестве примеров мож­но привести димеризацию рецепторов после связывания с ними лигандов, димеризацию некоторых интермедиатов сигнальных систем, димеризацию факторов регуляции транскрипции. Наблюдается как гомо-, так и гетеродимеризация (олигомеризация). У животных механизм димеризации тирозин-киназных рецепторов клеточной мембраны характерен, например, для трансдукции полипептидных гормонов (ростовой фактор плаценты и др). Серин/трео-нин-киназные рецепторы функционируют подобным же образом. Мало известно о том, какие формы рецепторов -мономерные, гомодимерные или гетеродимерные - прини­мают участие в преобразовании элиситорных сигналов в клетках растений. Предложена схема гетеродимерного ре-


цептора [Trotochaud et al., 1999], который активируется ли-гандом, что приводит к фосфорилированию цитозольного киназного домена и активации ассоциированных с ним белков, часть из которых передает сигнальный импульс следующим интермедиатам сигнальных систем. Одним из ассоциированных белков является протеинфосфатаза, инактивирующая киназный домен.

У животных клеток тирозин-киназный рецептор состо­ит из трех доменов - экстраклеточного, трансмембранно­го и обращенного в цитозоль. Специфика структуры пер­вого и третьего доменов (заключающаяся, например, в том, что они не способны фосфорилироваться) определя­ет, с одной стороны, с каким гормоном взаимодействует рецептор и, с другой, какие сигнальные системы "включа­ет" этот гормон. Взаимодействие внешнего домена с сиг­нальным лигандом приводит к автофосфорилированию тирозинового остатка этого домена, что повышает его ки-назную активность. Обычно протеинкиназы содержат не­сколько мест фосфорилирования. Это относится и к ре-цепторным протеинкиназам. Цитоплазматический домен мономерной формы рецептора фактора роста у животных клеток содержит, по крайней мере, девять автофосфори-лируемых тирозиновых остатков [Heldin, 1995]. Один из них - Тир 857 - важен для проявления киназной активности, а восемь других определяют специфику связи с молекула­ми, преобразующими сигнал. Есть основания полагать, что те же принципы функционирования рецепторов ис­пользуются и в клетках растений, однако в них найдены главным образом серин-треониновые рецепторные проте­инкиназы, участвующие в патогениндуцированных защит­ных реакциях растений.


В настоящее время 18 рецепторподобных серин-треони-новых протеинкиназ арабидопсиса подразделяют [Hardie, 1999] в зависимости от структуры их экстраклеточного до­мена на четыре группы:

1. Протеинкиназы с доменами, обогащенными лейцино-выми повторами, обычно характерными для фрагментов, участвующих в белок-белковых взаимодействиях. У живот­ных такие рецепторы связывают полипептидные (или пеп­тидные) сигнальные молекулы. Предполагают, что к этой группе относятся рецепторы брассинолидов с обогащенны-

ми лейцином повторами в N-концевой надмембранной об­ласти [Li, Chory, 1997; Cosgrove et al., 2000]. У томата был выделен ген аналогичного белка, но без цитозольного ки-назного домена [Jones et al., 1994].

2. Протеинкиназы с S-доменами, в которых имеется
много остатков цистеина.

  1. Протеинкиназы с доменами, обогащенными лейцино-
    выми повторами, но, в отличие от первой группы, связан­
    ные с лектинами. Это создает возможность рецепции этими
    протеинкиназами олигосахаридных элиситоров.

  2. Протеинкиназы, связанные с клеточной стенкой.

В эти группы не вошли некоторые протеинкиназы, в частности протеинкиназа, имеющая экстраклеточный домен, связывающийся с белком, который накапливается в межклеточном пространстве при инфицировании расте­ний различными патогенами. Как уже отмечалось, многие рецепторные киназы могут взаимодействовать с другими белками, и это обеспечивает как большее разнообразие связываемых химических сигналов, так и регуляцию этих процессов. Возможно, упомянутая протеинкиназа являет­ся одним из рецепторных белков, отвечающих за защит­ные реакции растений.

Одним из древних, консервативных и широко распро­страненных типов мембранных рецепторов являются трансмембранные автофосфорилирующие гистидинкина-зы [Loomis et al., 1997], способные активироваться широ­ким кругом элиситорных сигнальных молекул. Связыва­ние элиситора внешним, выступающим над липидным сло­ем плазмалеммы N-концевым участком рецептора вызы­вает изменение его конформации и автофосфорилирова-ние гистидинового остатка (см. рис. 4). Затем остаток фо­сфорной кислоты передается на аспартатный остаток вну­треннего (цитоплазматического) участка белка [Chang, Meyerowitz, 1995; Hahn, 1996; Chang, Stewart, 1998], что так­же вызывает изменение его конформации и, вследствие этого, активацию ассоциированного с рецептором фер­мента (непосредственно или через посредников - чаще всего G-белки). Активация фермента - важнейшее звено сигнальной системы, целью которой является передача и умножение элиситорного сигнала, завершающиеся экс­прессией защитных генов и появлением белков, которые

определяют ответ клеток и растения в целом на инфици­рование и воздействие элиситоров. Специфичность рецеп­торов к элиситорам определяется вариабельным внешним N-концом белка, а специфичность к ферменту - его внут­ренним С-концом. Показано, что этот тип рецепторов взаимо­действует со стрессовым фитогормоном этиленом IBleecker et al., 1998; Hua, Meyerowitz, 1998; Theologis, 1998; Woeste, Kieber, 1998; Alonso et al., 1999; Chang, Shockey, 1999; A.E. Hall et al., 1999; Hirayama et al., 1999; Cosgrove et al., 2000; Savaldi-Goldstein, Fluhr, 2000; и др.], который элиситирует защитные реакции клеток растений. Клонирова­ние и определение первичной структуры гена гистидино­вого рецептора у арабидопсиса показали, что его N-конце­вой мембранный домен похож на транспортеры ионов ме­таллов [Alonso et al., 1999].

В настоящее время описан трансмембранный рецепторный белок, N-конец которого взаимодействует с клеточной стенкой, а С-конец находится в цитоплазме и обладает свой­ствами серин-треониновых протеинкиназ [Kohorn et al., 1996]. По мнению авторов, этот рецепторный белок осуще­ствляет сигнальные функции, обеспечивая сигнальный кон­такт между клеточной стенкой и внутренним содержимым клетки.

Так как взаимодействие сигнальной молекулы и ре­цептора осуществляется без возникновения между ними ковалентных связей, то нельзя исключить возможности их расстыковки. С другой стороны, ассоциация этих двух типов молекул может быть достаточно прочной, а изме­нение конформации рецепторного белка создает предпо­сылки облегчения атаки на него протеаз, распознающих белки с нарушенной структурой и разрушающих эти мо­лекулы. В связи с этим большое значение приобретает способность клеток достаточно быстро восстанавливать численность рецепторов различных типов. Обращают на себя внимание опыты, посвященные изучению влияния ингибиторов синтеза белков на интенсивность связывания элиситоров рецепторными белками плазмалеммы. Оказа­лось, что обработка клеток циклогексимидом - ингибито­ром синтеза белков с участием цитоплазматических рибо­сом, вызывала достаточно быстрое снижение уровня свя­зывания клетками системина, что свидетельствует о вы-





сокой скорости оборота рецепторного белка 160 кда Имеются данные об элиситориндуцированном синтезе рецепторов, располагающихся в плазмалемме [Warren et al 1998], но, насколько известно, в настоящее время все еще отсутствует информация о степени специфичности синтеза того или иного рецепторного белка в зависимости от вида элиситора.

G-БЕЛКИ