ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 01.12.2019
Просмотров: 3398
Скачиваний: 3
К G-белкам относятся разнообразные белки, способные взаимодействовать с ГТФ [Gilman, 1987]. Одной из важнейших функций G-белков является участие в функционировании целого ряда сигнальных систем клеток растений (аде-нилатциклазной, МАР-киназной, фосфатидатной, кальциевой, липоксигеназной, НАДФН-оксидазной). Если считать первым звеном этих сигнальных систем трансмембранный рецепторный белок, то в роли второго выступает гетеро-тримерный комплекс G-белков, состоящий из а-, (3- и у-субъ-единиц. Непосредственно с цитозольным С-участком рецептора взаимодействует у-субъединица, а (3-субъединица объединяет ее с неактивной а-субъединицей, содержащей связанную молекулу ГДФ. При связывании лиганда, например элиситора, с внешним (N) участком трансмембранного рецептора происходит изменение его конформации, которое передается на ассоциированный с ним гетеротример-ный комплекс G-белков. В результате изменения конформации последнего происходит реакция переноса концевого фосфата цитоплазматического ГТФ на ГДФ, связанный с а-субъединицей, что приводит к ее активации, выходу из комплекса и взаимодействию с аденилатциклазой или другим стартовым сигнальным ферментом, что обусловливает активацию этого фермента. Через сравнительно непродолжительное время происходит дефосфорилирование ГТФ, входящего в состав а-субъединицы (ее переход в неактивную форму), и восстановление исходной структуры неактивного комплекса, связанного с рецептором. Такие циклические преобразования, сопровождающиеся превращением цито-зольного ГТФ в ГДФ, обеспечивают как передачу сигнала от рецептора к первому ферменту той или иной сигнальной системы, так и прерывание через некоторое время сигналь-
ной цепи, что также является необходимым условием эффективной работы любой сигнальной системы. Необходимо заметить, что прерывание сигнальных цепей достигается и с помощью других механизмов, о которых будет упоминаться в следующих главах.
Описанная картина участия гетеротримерных комплексов G-белков в передаче сигнального импульса была основательно изучена у животных объектов и давно вошла в учебники [Lehninger et al., 1993]. В растениях эти комплексы G-белков также функционируют [Hooley, 1998; Bischoff et al., 1999], причем обнаружены все компоненты гетеротримерного комплекса G-белков. Клонированы и охарактеризованы гены а-субъединиц [Iwasaki et al., 1997; Aharon et al., 1998; Kaydamov et al., 2000; Perroud et al., 2000], принимающих участие не только в активации первых ферментов сигнальных систем [Chapman et al., 1998; Machady et al., 1998; Roos et al., 1999], но и кальциевых каналов [Aharon et al., 1998]. Обнаружено, что ос-субъединица прикреплена к плазмалемме и эндоплазмати-ческой сети, но не к мембранам ядра или хлоропластов [Weiss et al., 1997]. Клонирован и охарактеризован также ген |3-субъ-единицы [Kaydamov et al., 2000]. Подавление функционирования гетеротримерного комплекса приводило к нарушениям морфологических признаков у растений риса, в том числе к появлению карликовых форм [Fujisawa et al., 1999].
Помимо "классических" гетеротримерных форм G-белков у растений обнаружены также "сверхкрупные" G-белки [Lee, Assmann, 1999] и малые G-белки (small G-proteins) [Mulligan et al., 1997; Palme et al., 1997; Ichinose et al., 1999; Valster et al., 2000], гомологичные открытым ранее у животных. Недавно проведена систематизация генов всех форм G-белков [Bischoff et al., 1999]. Структура малых G-белков напоминает а-субъединицу гетеротримерного комплекса. В их состав входят рецепторсвязывающая область и ГТФ / ГДФ-связывающее место.
Функции малых G-белков в растениях в настоящее время интенсивно изучаются. Обнаружено, что они принимают участие в организации актинового цитоскелета, образовании активных форм кислорода (функционировании НАДФН-оксидазы) и апоптозе клеток [Kawasaki et al., 1999], входе ионов кальция в клетки [Н. Li et al., 1999], активации фосфолипазы Д [Holbrook et al., 1999; С. Wang, 2000;
X. Wang, 2000]. Для изучения участия G-белков в различных сигнальных цепях клеток часто используют активатор G-белков - мастопаран [Blumwald et al., 1998; Chapman et al., 1998; Machady et al., 1998; Roos et al., 1999].
Участие в сигнальных системах, включаемых элисито-рами, предполагает достаточно важную роль G-белков в выработке защитных реакций клеток растений по отношению к патогенам. В связи с этим обращают на себя внимание факты патоген- и элиситориндуцированного образования G-белков [Ichinose et al., 1999] и обнаруженных ранее [Ueda et al., 1998] ингибиторов диссоциации комплексов G-белков [Kim et al., 1999].
Представляется необходимым отметить роль ферментативного липидирования и делипидирования в функционировании мембранных рецепторов и G-белков. Прикрепление белков к мембранам осуществляется с помощью пост-трансляционно приобретенных гидрофобных остатков, которые погружаются в липидный материал мембран, выполняя роль корешков, удерживающих большую молекулу белка на мембране. Ферментативное отщепление гидрофобного (липидного) остатка переводит белок из связанного с мембраной состояния в свободное, что может существенно изменить функции этого белка [Casey, 1995]. Детальный механизм регуляции активности этих ферментов остается недостаточно выясненным.
Обнаружено, что 16-углеродные остатки пальмитиновой кислоты могут быть перенесены на белок с образованием тиоэфирной связи с цистеином белка.
Пальмитоил-S-KoA + HS-белок —> —> Пальмитоил-Б-белок + HS-KoA
Пальмитоильный остаток может впоследствии замещаться ацильными остатками других жирных кислот. При переносе на белок остатка 14-углеродной миристиловой кислоты она взаимодействует с аминогруппой N-концевого глицина с помощью N-миристоилтрансферазы. Еще один способ усиления связывания с мембранами различных белков - их пренилирование, осуществляющееся путем переноса 15-углеродного фарнезильного или 20-углеродного гера-нилгеранильного остатков на HS-группу цистеина, расположенного близ С-конца белка.
О роли прикрепления к белкам гидрофобных остатков можно судить по следующим фактам. Депальмитоилирова-ние мембранных рецепторов может способствовать их освобождению из плазмалеммы, что приведет к невозможности восприятия элиситорных сигналов. Известна важная роль в функционировании сигнальных систем "липидированных" G-белков, осуществляющих передачу сигнального импульса от мембранных рецепторов к стартовым ферментам сигнальных цепей. Обратимое пальмитоилирование ос-субъединицы этого белка может изменять его сигнальную активность. у-Субъединица G-белка пренилирована, и это определяет связь с мембраной комплекса у- и р-субъединиц. Могут быть пренилированы и малые G-белки, также участвующие в передаче и преобразовании элиситорных сигналов от рецепторов к интермедиатам сигнальных цепей. Опубликовано несколько работ с описанием элиситориндуцированного перехода некоторых белковых интермедиатов сигнальных систем из растворимого (в цитозоле) состояния в связанное с плаз-малеммой, что, по-видимому, определялось их липидироваи-ем. Примером может служить переход фосфолипазы D из растворенного в мембраносвязанное состояние, вызванный действием экзогенной абсцизовой кислоты [Ryu, Wang, 1995]. В связывании с мембранами кальцийзависимых проте-инкиназ играет большую роль меристоилирование N-конца молекулы [Hrbak et al., 1996; Romeis et al., 2000].
Сравнительно недавно стало ясно, что большую роль во внутриклеточном преобразовании сигналов играют вспомогательные белки, не преобразующие сигналы, но имеющие "стыковочные" домены, способные связывать сигнальные белки. В связи с тем, что один вспомогательный белок может иметь несколько одинаковых или отличающихся стыковочных (достаточно консервативных) доменов, то он может обеспечивать формирование достаточно сложного белкового комплекса, облегчающего взаимодействие между звеньями сигнальных цепей, такими как, например, рецепторы, G-белки, протеинкиназы, факторы регуляции транскрипции, протеинфосфатазы, цитоскелетные белки, такие ферменты, как NO-синтаза. Взаимодействие между вспомогательными белками, а также между ними и сигнальными белками регулируется с помощью различных механизмов, одними из которых являются реакции фосфорили-
рования-дефосфорилирования определенных остатков аминокислот в белках.
Вспомогательные белки подразделяются на объединяющие (scaffold), заякоривающие (anchoring) и адапторные IPawson, Scott, 1997]. Если в двух последних типах белков обычно взаимодействуют два партнера, то в первом объединяющий белок "навешивает" на себя несколько сигнальных белков. У дрозофилы был найден ген, кодирующий объединительный белок с пятью "стыковочными" PDZ-до-менами, обеспечивающий организацию сигнального комплекса. Мутации этого гена (даже в области одного PDZ-до-мена) приводят к серьезным нарушениям распределения сигнальных молекул внутри клеток. Вышеупомянутый белок обеспечивает преобразование светового сигнала в светочувствительной клетке глаза дрозофилы. С помощью пяти модулей (PDZ) он связывает в единый комплекс гете-ротримерный G-белок (взаимодействующий с фоторецептором родопсином), фосфолипазу С, протеинкиназу С, кальциевый канал, кальмодулин [Tsunoda et al., 1997]. Можно ожидать, что у растений имеются подобные объединяющие белки, если исходить из принципа унификации структуры и функций как генома, так и обслуживающих его механизмов [Гречкин, Тарчевский, 2000]. Кроме того, уже обнаружены однотипные обслуживающие белки у растений и животных, например адапторный димерный белок 14-3-3, каждая субъединица которого узнает и связывает фосфосериновый остаток одного из двух различных сигнальных белков, в результате чего происходит их объединение в единый функционирующий сигнальный комплекс. Ключевыми для связывания могут быть и фосфотирозиновые остатки. Один из типов стыковочных доменов имеет полипролиновую последовательность аминокислот. Усиливает способность образовывать сигнальные олигомеры обратимое преобразование сульфгидрильных групп остатков цистеина в межмолекулярные дисульфидные в N-концевой области взаимодействующих сигнальных и вспомогательных белков [Pawson, Scott, 1997]. Функционированием вспомогательных белков объясняют явления локализации и кластеризации рецепторов и ионных каналов, а также специфику реализации одного и того же сигнала в клетках различных тканей.
ПРОТЕИНКИНАЗЫ
И ПРОТЕИНФОСФАТАЗЫ
Эффективным и широко распространенным способом изменения активности ферментов и других белков является один из видов их посттрансляционной модификации - фос-форилирование входящих в них аминокислот. Так как остаток ортофосфорной кислоты обычно (в условиях внутриклеточного диапазона рН) несет отрицательный заряд, то его появление в белке приводит к изменению суммарного локального электрического заряда и в связи с этим конфор-мации и активности белка. Реакции фосфорилирования белков катализируют различные виды протеинкиназ, которые привлекают большое внимание исследователей в связи с их ключевой ролью в регуляции функционирования клеток, в том числе в работе сигнальных систем [Hardie, 1999; Schenk, Snaar-Jagalska, 1999]. Описанию принципов строения и классификации протеинкиназ посвящен целый ряд обзорных статей [Hunter, 1995; Stone, Walker, 1995; Hardie, 1999; Walker-Simmons, 1998; Hardie, 1999; Jouannic et al., 1999b; Cohen, 2000; и др.].
В настоящее время у эукариотических организмов описано около 1000 представителей этих ферментов [Hardie, 1999], причем почти половина из них - у растений [Cohen, 2000]. Эти ферменты катализируют реакцию переноса концевого ортофосфата от АТФ на некоторые аминокислотные остатки белков:
Белок + АТФ —> Белок-Ф + АДФ
Все протеинкиназы подразделяются на пять подсемейств, в зависимости от тех остатков аминокислот, которые они фосфорилируют в белках-субстратах протеинки-назных реакций [Hardie, 1999]: рецепторные двухкомпо-нентные гистидиновые протеинкиназы с автокаталитиче-
ским переносом фосфатного остатка с гистидина на собст-венный аспартат; гистидиновые; серин-треонинспецифич-ныe; тирозиновые; протеинкиназы двойной специфичности, способные функционировать и как серин-треониновые, и как тирозиновые. Многие представители этих подсемейств принимают участие в функционировании сигнальных систем клеток растений.
За последние годы большинство генов протеинкиназ клонировано (только у арабидопсиса - около 200), и пер-вичная структура как этих генов, так и кодируемых ими протеинкиназ была расшифрована, что позволило рассматривать вопросы молекулярной эволюции этих ферментов | Hardie, 1999] и их структурной принадлежности к различным семействам и подсемействам. Сопоставление функциональных особенностей различных протеинкиназ позволило провести дополнительную классификацию этих ферментов, подразделить их на следующие подсемейства (здесь приводятся главным образом те из них, которые имеют непосредственное отношение к функционированию сигнальных систем): кальцийзависимые; АМФ-зависимые (при голодании клеток снижается содержание АТФ и повышается - АМФ, что активирует протеинкиназы этой группы), обозначаемые также как SNF PK (sucrose non-fermenting protein kinases); рецепторные киназы, образующие активные гомо- или гетеродимеры после связывания с сигнальными молекулами (лигандами); митоген-активируемые протеинкиназы, причем у арабидопсиса клонировано семь МАР-ки-наз и по пять МАР-киназ киназ и МАР-киназ киназ киназ; циклинзависимые протеинкиназы (активируемые белками-циклинами), принимающие участие в прохождении клеточных циклов; казеиновые киназы, принимающие участие, например, в фосфорилировании факторов регуляции транскрипции и стимулировании их связывания с промоторными участками генов; протеинкиназы группы CTR 1/Raf, принимающие участие в "сопряжении" ГТФ-связывающего белка (G-белка) Ras с МАР-киназами, в частности, в индуцируемом этиленом МАР-киназном сигнальном каскаде.