Файл: Методичка по мікробіології.doc

Початок досліду відмічають за секундоміром в той момент, коли посудину з перекисом водню перекидають і вміст колби струшують. Збовтування суміші проводять протягом всього досліду, тримаючи колбу за горлечко. Кисень, що виділяється, витісняє з бюретки воду, рівень якої відмічають через 0,5; 1; 2 і 3 хвилини.

Активність каталази виражають в см³ кисню, що виділився за 1 хвилину на 1 г ґрунту. Дані вимірювань заносять в таблицю.

Результати роботи оформляють у вигляді звіту.

Лабораторна робота № 15

Тема: Дослідження бактерій кореневої зони рослин

Мета: визначити якісний та кількісний склад бактерій кореневої зони рослин

Матеріали й устаткування: ґрунтовий моноліт з рослинами розміром 10х10 см, пінцети, ножиці, часове скло, колби на 250 мл, стерильна водопровідна вода, колби та вода для розведень, пісок, стерильні піпетки на 1 мл, піпетки Мора, стерильні шпателі, розрахункова камера Горяєва, мікроскопи, МПА в пробірці

Теоретичні положення

Відомо, що чим ближче ґрунт розташовується до кореневої системи рослин, тим більшу кількість бактерій він має. Але особливо багато бактерій безпосередньо на поверхні коріння. Сукупність цих бактерій називають ризопланою.

В ґрунті, який прилягає до коренів (ризосфера) додатковим джерелом живлення бактерій є відмираючі клітини епідермісу, кореневі волоски, а також продукти екзосмосу рослин (кореневі виділення). В ризосфері розвиваються такі ж самі форми бактерій, що і в ґрунті, який віддалений від коренів. Як правило, на корінні розвиваються неспороносні палички роду Pseudomonas та мікобактерії.

Бактерії кореневої зони рослин є санітарами, очищуючи зону кореня від продуктів метаболізму рослин; мінералізують органічні рештки, переводячи ряд елементів живлення в доступну для рослин форму; продукують ростові речовини, вітаміни.

Деякі бактерії, які розвиваються в кореневій зоні і безпосередньо на корінні, мають денітрифікуючу здатність і при певних умовах можуть викликати великі втрати азоту з ґрунту, що має негативне значення.

Порядок виконання роботи

1. Підрахувати кількість бактерій в ризосфері методом Красильникова.

Стерильною лопатою підкопують ґрунт під рослинами, стерильним пінцетом добувають та вилучають коріння. Ґрунт, який прилип до коренів, струшують у стерильну чашку Петрі, перемішують і беруть наважку ґрунту 1 г (одночасно беруть наважку для визначення вологості ґрунту). Потім 1 г ґрунту поміщають в 100 мл стерильної водопровідної води і готують ряд розведень: 10^-2, 10^-3, 10^-4.

При поверхневому посіві з одержаних розведень стерильною мікропіпеткою наносять 0,05 мл на поверхню МПА і шпателем досуха втирають в агар. При глибинному посіві з розведень стерильною піпеткою беруть 1 мл суспензії і вносять в стерильну чашку Петрі. Потім додають 15–20 мл охолодженого до 40–45ºС агаризованого поживного середовища.

Колонії, які виросли на агарі, підраховують візуально і під лупою. Для визначення кількості бактерій в 1 г ґрунту при глибинному посіві кількість колоній, що виросли, перемножують на відповідне розведення і ділять на масу абсолютно сухого ґрунту, який міститься в 1 г сирого ґрунту. При поверхневому посіві, для встановлення числа бактерій в 1 мл, кількість колоній на чашці Петрі перемножують на 20.

Для визначення якісного складу бактерій колонії розподіляють за культуральними ознаками. З кожної групи готують препарат і виявляють форму колоній. Для визначення видових ознак з колоній роблять пересів на скошений агар і після очистки культури вивчають її морфологічні та фізіологічні ознаки стандартними методами.

2. Облік ризосферної і кореневої мікрофлори методом послідовних відмивок коренів за Є.З. Теппер.

З викопаних монолітів ґрунту з рослинами стерильним пінцетом і ножицями відбирають 1 г молодих коренів (приблизно однакового діаметру) з прилиплими частками ґрунту (одночасно беруть наважку для визначення вологості ґрунту). Коріння поміщають в колби з 100 мл стерильної водопровідної води і збовтують протягом 2 хвилин. За допомогою стерильного крючка корені дістають із колби і переносять послідовно в другу, третю, четверту, п’яту, шосту, сьому колби, які також містять по 100 мл стерильної водопровідної води. В кожній колбі корені відмивають по 2 хвилини. В останню колбу перед стерилізацією додають 3–5 г піску.

Для якісного аналізу бактерій ризосфери з кожної колби окремо стерильною піпеткою беруть 0,05 мл відмивної води, наносять на поверхню МПА і окремим шпателем втирають досуха. Чашки поміщають в термостат при температурі 28–30ºС на 3–5 діб.

По мірі відмивань коріння чисельність бактерій не зменшується, а в ряді випадків збільшується. При цьому в чашках з перших відмивань багато великих колоній, які представлені спороносними формами. Але надалі кількість бацилярних форм зменшується і збільшується число неспороносних форм роду Pseudomonas та мікобактерій, які часто забарвлені в жовтий і оранжевий колір.

Для кількісного аналізу бактерій ризосфери суспензію з першого відмивання додатково збовтують 5 хвилин. Потім з неї готують розведення і роблять поверхневі посіви на МПА. Вміст шести останніх колб зливають разом, готують послідовні розведення і роблять поверхневі посіви на МПА.

Для підрахунку бактерій-зародків в 1 г абсолютно сухого ґрунту ризосфери число колоній на чашці перемножують на 20 (для визначення числа бактерій в 1 мл) і на ступінь розведення, а потім ділять на масу абсолютно сухого ґрунту ризосфери. Кількість ризосферного ґрунту, що потрапила з корінням в першу колбу, знаходять за різницею між першою наважкою і наважкою відмитих коренів. Для цього з кожної порції відмитої води корені дістають, поміщають на фільтрувальний папір для вилучення води і зважують.

Для визначення кількості мікроорганізмів на 1 г коріння число колоній, яке виросло на чашці Петрі, перемножують на 20, ступінь розведення і 600 (6 змивів по 100 мл в кожному) і ділять на масу сирих коренів.

СПИСОК РЕКОМЕНДОВАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Аникеев В.В. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / В. В. Аникеев, К. А. Лукомская. – М. : Просвещение, 1983. – 127 с.

2. Асонов Н. Р. Микробиология / Н. Р. Асонов. – М. : Колос, 2001. – 352 с.

3. Бранцевич Л. Г. Микробиология: практикум / Л. Г. Бранцевич. – К. : Вища школа, 1987. – 200 с.

4. Векірчик К. М. Мікробіологія з основами вірусології / К. М. Векірчик. – К. : Либідь, 2001 – 312 с.

5. Векірчик К. М. Практикум з мікробіології / К. М. Векірчик. – К. : Либідь, 2001 – 144 с.

6. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий / Г. Готтшалк. – М. : Мир, 1982. – 310 с.

7. Градова Н. Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии / Н. Б. Градова. – М. : ДеЛи принт, 2001. – 131 с.

8. Емцев Т. В. Микробиология / Т. В. Емцев, В. К. Шильникова. – М. : Агропромиздат, 1990. –190 с.

9. Заварзин Г. А. Бактерии и состав атмосферы / Г. А. Заварзин. – М. : Наука, 1984. – 193 с.

10. Нейман Б. Я. Индустрия микробов / Б. Я. Нейман. – М. : Изд-во Знание, 1983. – 207 с.

11. Общая микробиология / под ред. А. Е. Вершигоры. – К. : Вища школа, 1988. – 343 с.

12. Определитель бактерий Берджи в 2-х т. / под ред. Дж. Хоулта и др. – М. : Мир, 1997. – 432 с.

13. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии / под ред. А. А. Воробьева, Ю. С. Кривошеина. – М. : Мастерство; Высшая школа, 2001. – 224 с.

14. Перт Дж. С. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / Дж. С. Перт. – М. : Мир, 1978 – 384 с.

15. Пименова М.Н. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / М. Н. Пименова, Н. Н. Гречушкина, Л. Г. Азова. – М. : Изд-во МГУ, 1971. – 220 с.

16. Практикум по микробиологии / под ред. Н. С. Егорова. – М. : Изд-во МГУ, 1976. – 307 с.

17. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / под ред. Н. С. Егорова – М. : Изд-во МГУ, 1983. – 215 с.

18. Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрем Дж. Мир микробов. – Т. 1, 2, 3. – М. : Мир, 1979.

19. Теппер Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г. И. Переверзева. – М. : Агропромиздат, 1987. – 239 с.

20. Функціонування мікробних ценозів ґрунту в умовах антропогенного навантаження / К. І. Андреюк та ін. – К. : Обереги, 2001. – 240 с.

21. Г. Шлегель. Общая микробиология / под ред. Е. Н. Кондратьевой. – М. : Мир, 1987. – 567 с.

ДОДАТКИ

Додаток 1 (до ЛР №5)

Схема будови бактеріальної клітини:

1 – капсула; 2 – плазматична мембрана; 3 – клітинна стінка; 4 – рибосоми; 5 – мезосоми; 6 – газові вакуолі (аеросоми); 7 – генофор (нуклеоїд); 8 – хроматофори, тилакоїди; 9 – хлоросоми, фікобілісоми; 10 – цитоплазма; 11 – плазміда; 12 – гранули включень (глікоген, гранульоза, волютін, жир, полі--оксибутират, сірка, магнітосоми); 13 – джгутик.

Будова бактеріальної клітини

Бактерії – це примітивні одноклітинні організми прокаріотичного типу, що не мають обмеженого мембраною ядра. Як правило, складаються з поверхневих структур, клітинної оболонки, а також цитоплазми з включеннями і нуклеоїдом. У клітинній оболонці бактерій розрізняють капсулу, клітинну стінку і цитоплазматичну мембрану.

Капсула утворюється у деяких мікроорганізмів у вигляді слизуватого шару, що складається з полісахаридів, іноді утримуючи поліпептиди. Капсула охороняє клітину від висихання, захищає від несприятливих впливів макроорганізмів (фагоцитів, антитіл).

Капсули й поверхневі структури – джгутики та мікроворсинки – важливі діагностичні ознаки, їх використовують для ідентифікації мікроорганізмів.

Відповідно до класифікації Берджі, в основі якої лежить будова клітинної стінки, бактерії поділяються на 4 відділи: грацилікути – із тонкою клітинною стінкою (грамнегативні), фірмікути – із товстою клітинною стінкою (грампозитивні), тенерикути – без ригідної клітинної стінки (мікоплазми), мендозикути – із дефектною клітинною стінкою (архебактерії).

Клітинна стінка – ригідна (тверда, міцна, пружна) структура, що додає бактерії визначену форму. Разом із цитоплазматичною мембраною вона захищає клітину від шкідливих факторів і бере участь у регуляції осмотичного тиску, транспорті речовин і енергетичному метаболізмі клітини. Основним компонентом клітинної стінки грампозитивних бактерій є багатошаровий гетерополімер пептидоглікан (муреїн, мукопептид), що складає 40–90 % її маси, і тейхоєві кислоти. Пептидоглікан складається з залишків, що чергуються, N-ацетилглюкозаміна і N-ацетилмурамової кислоти, з'єднаних між собою 1,4-глікозидними зв'язками. Тейхоєві кислоти – це полімери гліцерину чи рибіта, з'єднаних фосфодіефірними зв'язками. Здатність грампозитивних бактерій під час забарвлення за Грамом утримувати генціановий фіолетовий у комплексі з йодом пов'язана з властивістю багатошарового пептидоглікану взаємодіяти з барвником. Наступна обробка мазка бактерій спиртом викликає звуження пор у пептидоглікані і затримку барвника в клітинній стінці.

Грамнегативні бактерії, стінки яких містять меншу кількість пептидоглікану, після обробки спиртом знебарвлюються і під час додаткової обробки фуксином зафарблюються в червоний колір.