Файл: Методичка по мікробіології.doc

ЛАБОРАТОРНИЙ ПРАКТИКУМ

Лабораторна робота № 1

Тема: Будова світлопольного мікроскопу. Види мікроскопії

Мета: ознайомитися з особливостями роботи в мікробіологічній лабораторії та технікою безпеки. Вивчити будову світлопольного мікроскопу, його механічну та оптичну системи, типи сучасних мікроскопів та правила користування ними в мікробіологічній практиці

Матеріали й устаткування: мікроскопи МБР, МБД, набори об’єктивів та окулярів, конденсорів, предметні та покривні скельця, імерсійна олія

Теоретичні положення

Для вивчення морфології мікроорганізмів у прохідному світлі використовують оптичні мікроскопи МБР (рис. 1.1), МБД.

Механічна частина складається зі штатива з предметним столиком, тубуса, револьвера, механізму наведення різкості, що складається з макрометричного й мікрометричного гвинтів.

Оптична частина мікроскопа включає об'єктив і окуляр. Об'єктив є найважливішою частиною мікроскопа. Він складається із системи лінз, укладених у металеву оправу. Одне з позначень на оправі відповідає значенню збільшення об'єктива. В мікроскопі МБР використовуються об'єктиви, що дають збільшення в 8, 40 і 90 разів. Це багатолінзові короткофокусні системи, від якості яких залежить, в основному, зображення об’єкту. Збільшення об'єктива залежить від фокусної відстані головної – фронтальної лінзи. Чим більше кривизна фронтальної лінзи, тим коротше фокусна відстань, тобто тим нижче треба опускати об'єктив над площиною препарату. Інші лінзи називаються корекційними, вони необхідні для усунення сферичної й хроматичної аберації.

Об’єктив дає дійсне, збільшене, зворотне зображення предмету.

Окуляр містить дві лінзи – очну (верхню) і польову або збірну (нижню). Польові лінзи збирають промені, які йдуть від об’єктиву. Очна лінза збільшує зображення, яке дає об’єктив. Окуляри можуть давати збільшення в 5, 7, 10, 12, 15 і 20 разів, що зазначено на їхній оправі.

Окуляр дає збільшене, уявне, пряме зображення по відношенню до зображення, яке дає об’єктив. Окуляри можуть бути різних типів, їх вибір залежить від об’єктивів.

Освітлювальна система включає дзеркало з двома поверхнями (увігнутою та плоскою) і конденсора (у мікроскопі МБД є убудоване джерело світла). Увігнуте дзеркало збирає й концентрує в площині препарату пучок рівнобіжних променів світла, що йдуть від джерела світла, тому їм користаються в тих випадках, коли працюють без конденсора, тобто з малим збільшенням. Конденсор, укріплений безпосередньо над дзеркалом, складається з двох лінз і призначений для збирання паралельних променів світла, відбитих дзеркалом, у

Рис. 1.1. Мікроскоп МБР-1:

1 – основа мікроскопа; 2 – предметний столик; 3 – гвинти для переміщення предметного столику; 4 – клеми для фіксації препарату; 5 – конденсор; 6 – кронштейн конденсора; 7 – гвинт, що закріплює конденсор у гільзі; 8 – гвинт переміщення конденсора; 9 – ручка ірисової діафрагми конденсора; 10 – дзеркало; 11 – тубусоутримувач; 12 – макрометричний гвинт (кремальєра); 13 – мікрометричний гвинт; 14 – револьвер; 15 – об’єктиви; 16 –тубус; 17 –гвинт для кріплення тубуса; 18 – окуляр.

крапці-фокусі, що знаходиться в площині препарату. Убудована в конденсор ірисова діафрагма служить для затримання зайвих променів світла і дозволяє при необхідності зменшувати апертуру конденсора.

Загальне збільшення, що дає мікроскоп, визначається добутком збільшення об'єктива на збільшення окуляра. Виразність одержуваного зображення характеризується дозвільною здатністю, що визначається мінімальною відстанню між двома крапками, коли вони ще не зливаються в одну.

Величина дозвільної здатності мікроскопа залежить від довжини хвилі використовуваного світла () і суми числових апертур об'єктива (A₁) і конденсора (A₂):

(1.1)

Числова апертура (A) визначається добутком синуса половини кута охоплення лінзи (U)та показника заломлення середовища (n), що граничить із лінзою: A = sin U·n. Тобто числова апертура характеризується кількістю променів, що попадають у лінзу (рис. 1.2).

Дозвільна здатність мікроскопа – величина, зворотна дозвільної відстані. Чим більше дозвільна здатність, тим меншої величини об'єкт можна побачити. Світловий мікроскоп за умов використання видимого світла має дозвільну здатність близько 0,2 мкм.

Рис 1.2. Схема ходу променів із різною величиною отвірного кута:

А – об’єкт;

О – об’єктив;

 - отвірний кут;

U – половина отвірного кута.

Підвищити дозвільну здатність можна двома шляхами: висвітлюючи об'єкт більш короткими променями світла, наприклад, УФ, або, збільшуючи показник середовища, що граничить із лінзою, для того, щоб наблизити його до показника заломлення скла (n скла = 1,5). У вивченні мікроорганізмів майже постійно користаються імерсійним, або олієзануреним об'єктивом (90х), що дає збільшення у 900–1350 разів (рис. 1.3).

Р ис 1.3. Вплив імерсійної олії на хід променів у мікроскопі:

1 – об’єктив;

2 – предметне скло;

3 – об’єкт;

4 – імерсійна олія;

5 – промені світла;

6 – фронтальна лінза об’єктива.

Тому всі промені, не переломлюючись і не змінюючи свого напрямку, потрапляють в об'єктив і забезпечують гарну видимість дрібних об'єктів.

Мікроскопія в темному полі. Основи цього методу розроблено австрійським вченим Р. Зігмонді, він дає можливість підвищувати дозвільну здатність мікроскопу в 10 разів і використовується для дослідження об'єктів малої величини. Для цього в біологічному мікроскопі звичайний конденсор заміняють спеціальним конденсором темного поля, що має затемнену середню частину і пропускає тільки бічні промені.

Таким чином, мікроскопія в темному полі базується на висвітленні об'єкта косими променями світла (явище Тиндаля). Ці промені, не потрапляючи в об'єктив, залишаються невидимими для ока, тому поле зору виглядає зовсім чорним (рис. 1.4).

Рис. 1.4. Схема ходу променів у конденсорі темного поля:

1 – лінза конденсора;

2 – чорна пластинка;

3 – об’єктив.

Якщо препарат містить якісь частки, наприклад, мікроорганізми, то косі промені, проходячи через такий препарат, у значній мірі відбиваються від поверхні цих часток і, ухиляючись від свого первісного напрямку, попадають в об'єктив. Тоді спостерігач бачить на чорному фоні інтенсивно світні об'єкти з різким бічним контрастом. При цьому апертура конденсора повинна бути трохи більше апертури об'єктива (об'єктив необхідно діафрагмувати, а конденсор імергувати). Метод темного поля використовується для спостереження живих клітин мікроорганізмів.

Фазово-контрастна мікроскопія. Метод запропоновано голландським фізиком Ф. Церніке для спостереження за живими об’єктами.

Більшість препаратів живих мікроорганізмів слабо контрастні, тобто клітини мало відрізняються за забарвленням і прозорістю від навколишнього середовища. Проте світлова хвиля набуває певних змін: проходячи через ділянки препарату, що мають більший, ніж у навколишнього середовища показник заломлення, вона виходить із деяким відставанням за фазою. Спеціальний фазово-контрастний пристрій дозволяє оптичним шляхом перетворювати розходження за фазою в зміни амплітуди, у результаті чого живі прозорі об'єкти стають контрастними, їх можна побачити оком.

Оптична система, яка використовується для одержання фазового контрасту, складається з фазової пластинки в одній з лінз об'єктива, що має форму кільця, і кільцевої діафрагми в спеціальному конденсорному пристрої. Для одержання фазового ефекту необхідне точне сполучення фазового кільця з проекцією кільцевої діафрагми (рис. 1.5).

Метод фазового контрасту застосовується для дослідження живих клітин мікроорганізмів різних систематичних груп, контрастність яких досягається оптичним шляхом без втручання в фізіологічні процеси об’єктів, що вивчаються.

Рис. 1.5. Схема ходу променів із використанням фазово-контрастного пристрою:

1. – кільцева діафрагма;

2. – конденсор;

3. – об’єкт;

4. – об’єктив;

5. – фазова пластинка.

Люмінесцентна (флуоресцентна) мікроскопія. Вперше феномен люмінесценції для мікроскопічних досліджень було використано австрійським ученим А. Келером.

Деякі біологічні об’єкти здатні при освітленні короткохвильовими променями (синьо-фіолетовими, ультрафіолетовими) поглинати їх і випромінювати промені з більш довшою хвилею, при цьому виникає світіння жовто-зеленим або оранжевим кольором. Таке явище називається власною, або первинною, люмінесценцією.

Об’єкти, яким не притаманна первинна люмінесценція, можна обробити спеціальними флуорохромами (акридином жовтим, акридином оранжевим, аураміном, примуліном, конго червоним, тетрацикліном, хініном) і також спостерігати люмінесценцію, але це вже буде наведена, або вторинна люмінесценція. Препарати, забарвлені флуорохромами, вивчають на середовищах, що не здатні до люмінесценції (воді, гліцерині, фізіологічному розчині).

Оптична схема люмінесцентного мікроскопу відрізняється від схеми звичайного вибором джерела світла, а саме, заміною низько вольтової лампи на ртутну і наявністю на шляху променів двох світлофільтрів (синій – перед конденсором пропускає синьо-фіолетові промені видимого спектру, жовтий світлофільтр в окулярі мікроскопу гасить синьо-фіолетові промені, які заважають виявленню люмінесценції). Люмінесцентна мікроскопія – поєднання кольорового зображення з контрастністю об’єктів, дає можливість спостерігати за морфологією живих та мертвих клітин мікроорганізмів, досліджувати клітинні мікроструктури та функціонально-морфологічні зміни в клітині.

Електронна мікроскопія. Перший прототип сучасного електронного мікроскопа було побудовано радянським вченим Е. Руске. В електронному мікроскопі замість світлових променів використовують пучок електронів, які мають хвильові властивості. Нині широко використовують два типи електронних мікроскопів: трансмісійний і растровий.

В трансмісійному електронному мікроскопі пучок електронів рухається прямолінійно в безповітряному просторі від джерела електронів (розжарена нитка вольфрамової гармати) крізь досліджуваний об’єкт у напрямі до флуоресцентного екрану і викликає його світіння.

При дослідженні морфологічних особливостей клітин мікроорганізмів, їх товщина не повинна перевищувати 0,8–0,9 мкм. Контрастність зображення досягається за рахунок напилювання на досліджуваний об’єкт важких металів (хрому, золота, паладію) або обробки фосфорно-вольфрамовою кислотою і уранілацетатом.

Растровий електронний мікроскоп дозволяє отримувати об’ємне, тривимірне зображення об’єкта. Для цього тонкий рухомий електронний промінь дуже швидко і послідовно оббігає поверхню клітини і передає отриману інформацію на електронно-променеву трубку, що вкрита люмінофором.

Препарати для цього типу електронних мікроскопів піддають спеціальній обробці, основна мета якої – зневоднення об’єкту без порушення поверхні структур. Потім препарат вкривають тонким шаром сплаву золота або платини, що робить поверхню зразка електропровідною і дозволяє уникнути накопичення електричного заряду, який може знизити дозвільну здатність мікроскопа.

Порядок виконання роботи

1. Ознайомитися з правилами поведінки й техніки безпеки в мікробіологічній лабораторії.

2. Ознайомитися з будовою світлопольного мікроскопу (монокуляри, бінокуляри), які використовуються при виконанні лабораторних робіт з дисципліни.

3. Вивчити основні види мікроскопії, які застосовуються для дослідження живих клітин мікроорганізмів, а також встановити їх переваги та недоліки.

4. Визначити можливі варіанти загального збільшення світлопольного мікроскопу та його дозвільної здатності.

5. Замалювати малюнки згідно методичним вказівкам, зробити необхідні обчислення та висновки.

Лабораторна робота №2

Тема: Мікроскопічні дослідження мікроорганізмів різних систематичних груп. Прості методи забарвлення

Мета: освоїти методики приготування препаратів живих і фіксованих забарвлених мікроорганізмів та техніку мікроскопії

Матеріали й устаткування: постійні препарати культур мікроорганізмів різних систематичних груп (Streptococcus lactis, Micrococcus lisodeikticus, Lactobacillus acidophylum, Streptomyces recifensis, Staphylococcus aureus, Lactobacterium plantarum, Bacillus subtilis та ін.), природні субстрати, мікроскопи, предметні і покривні скельця, крапельниці з водою, бактеріологічні петлі, препарувальні голки, імерсійна олія, метиленовий синій, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, бензин, серветки, фільтрувальний папір, промивалка з дистильованої водою, розчин, що дезінфікує

Теоретичні положення

Мікроскопічні дослідження мікроорганізмів проводять в живому або фіксованому стані. Мікроскопія мікробних клітин в живому стані застосовується головним чином для вивчення їх розмірів, форми, структури, рухомості, характеру розмноження, відношення клітин до різних хімічних подразників. З цією метою найчастіше готують препарати роздавлена та висяча краплі.

Метод «роздавленої краплі». На чисте знежирене предметне скло мікробіологічною петлею наносять краплю суспензії мікроорганізмів. Якщо в культурі розвилося дуже багато бактерій, її розводять водою.

Покривне скло ставлять на ребро з краю краплі і поступово опускають на неї. Між скельцями не повинно залишатися пухирців повітря, які заважатимуть мікроскопії. Крапля повинна бути невеликою, щоб після «роздавлювання» рідина не виступала за край покривного скла. Препарат розглядають із сухою системою.

Метод «висячої краплі». Препарат «висяча крапля» використовують для виявлення рухливості мікроорганізмів. Крім того, можна довгостроково спостерігати за життєдіяльністю мікроорганізмів: розмноженням, утворенням і проростанням спор.

Для готування препарату невелику краплю суспензії мікроорганізмів наносять на покривне скло, перевертають його краплею вниз і поміщають на спеціальне предметне скло з поглибленням (лункою) у центрі. Крапля повинна вільно висіти, не торкаючись країв і дна лунки. Край лунки попередньо змазують вазеліном. Крапля виявляється герметично замкненою у вологій камері, що дозволяє багатоденне спостерігання за об'єктом.

Препарати розглядають під мікроскопом, злегка затемнюючи поле зору; конденсор трохи опускають, надходження світла регулюють увігнутим дзеркалом. З невеликим збільшенням знаходять край краплі, що буде чітко видний у затемненому полі зору. Край краплі пересувають у центр полю зору мікроскопа і переводять на велике збільшення, розширивши при цьому діафрагму. Більш чіткі результати можна одержати у темнопольній або фазово-контрастній мікроскопії.