Файл: Методичка по мікробіології.doc

Бульбочкові бактерії живуть на коренях бобових рослин (рід Раріlіопасеае). Проникаючи всередину кореневих волосків, вони утворюють нарости – бульбочки різної форми, розмірів і забарвлення.

Рід Rhizobium – це група аеробних, грамнегативних, неспороутворюючих бактерій. Мають складний цикл розвитку. Рухомі паличкоподібні клітини з віком гублять джгутики, нерівномірно фарбуються, а потім перетворюються у потовщені, роздуті грушоподібні або розгалужені утворення – бактероїди, які мають розпадатися на клітини кулястої форми.

Бульбочкові бактерії відрізняються специфічністю – кожний вид бактерій утворює бульбочки лише на коренях певних культур: люпину, сої, гороху, вики, квасолі, конюшини та інших; вірулентністю, тобто здатністю швидко проникати у кореневі волоски рослин, та активністю – здатністю фіксувати азот атмосфери. Неактивні штами бульбочкових бактерій утворюють на коренях дрібні зеленуваті бульбочки, в яких фіксація азоту не відбувається. Активні штами утворюють великі рожеві бульбочки, в яких азотфіксація відбувається дуже інтенсивно. Нітрагін готують з високо вірулентних та високоактивних штамів. Бульбочкові бактерії у симбіозі з бобовими рослинами можуть зв'язати за рік азоту: під люцерною – 500, під конюшиною – 300, під люпином – 150, під зернобобовими – 60–90 кг/га.

Порядок виконання роботи

1. Вивчити вільноживучі азотфіксатори.

Для виділення з ґрунту азотобактера використовують агарове безазотисте середовище Ешбі. Його розплавляють і розливають у стерильні чашки Петрі. Коли середовище застигне, на його поверхні розкладають 50 грудочок ґрунту. Чашки ставлять у термостат при 28°С. Через 5–7 днів спостерігають утворення навколо грудочок ґрунту бурі плями слизистих колоній Azotobacter chroococcum. Підраховують процент оброслих грудочок. З колоній готують мазки, фарбують фуксином 2 хвилини і мікроскопують з імерсією. Замальовують клітини азотобактера в зошит.

2. Вивчити симбіотичні азотфіксатори.

Відібрати свіжий корінь бобової рослини з добре розвиненими бульбочками, промити у воді і відрізати від нього найбільші бульбочки. Для знищення поверхневої мікрофлори, їх стерилізують 5 хвилин у 96 %-му етиловому спирті, а потім відмивають 5-кратно стерильною водою (переносять бульбочки послідовно в 5 пробірок із стерильною водою). Стерилізовану бульбочку кладуть у стерильну чашку Петрі, роздавлюють на шматочки профламбованим пінцетом або скальпелем, додають кілька крапель стерильної води. Готують фіксований препарат, фарбують фуксином 2 хвилини, мікроскопують з імерсією. Замальовують клітини бульбочкових бактерій в зошит.

Вивчаючи бульбочкові бактерії звернути увагу на те, що вони розповсюджуються у вигляді інфікованих плиток – колоній клітин бактерій, які розмножилися. В зрілій бульбочковій тканині бактеріальні клітини перетворюються в бактероїди, які мають грушоподібну гіллясту форму. Треба пам’ятати, що форма та розмір бульбочок різних бобових рослин неоднакові, а руйнування бульбочок супроводжується деградацією елементів рослинної клітини і лізисом частини бактероїдів. Останні бактероїди утворюють маленькі кулясті клітини – своєрідні артроспори, які виконують функцію розмноження.

Вивчення бульбочок бобових рослин вивчають на зрізах, які роблять гострою ботанічною бритвою або готують на мікротомі. Тонкий зріз, поздовжній або поперечний поміщають на предметне скельце і розглядають в роздавленій краплі при різних збільшеннях.

В сухій системі проглядають структуру бульбочок, знаходять бактерійну тканину, а потім при достатній тонкості зрізу препарат досліджують з імерсійною системою, при цьому добре проглядається бактероїдна зона бульбочок.

Для знайомства з формами різних видів бульбочкових бактерій готують фіксовані і зафарбовані препарати з бактероїдної тканини бульбочок різних бобових культур. Якщо бульбочки достатньо великі, їх розрізають бритвою на 2 частини і поверхню зрізу багатократно проколюють стерильною голкою, викликаючи механічне пошкодження клітини. Потім віджимають краплю рідини на предметне скельце і готують фіксований забарвлений препарат.

Для вивчення м’яких бульбочок (2–3 бульбочки) їх поміщають на предметне скло, добавляють краплю води, притискають зверху іншим предметним склом. Видавлений вміст розмазують по скельцю, мазок зафарблюють. Застосовують наступні фарбники: карболовий еритрозин, фуксин або генціанфіолетовий. Інтенсивне фарбування отримують при застосуванні суміші різних частин фуксину і метиленового синього, які розчинені в 1 %- ній оцтовій кислоті. В суміші барвників препарат витримують 3 хвилини. Тканина бульбочок зафарбовується в синій колір, а бактерії у червоний.

Форми і розміри бульбочкових бактерій, в тому числі і бактероїдів, із різних бобових замалювати, написати їх назву.

Лабораторна робота № 13

Тема: Загальний мікробіологічний аналіз ґрунту

Мета: визначити кількість мікроорганізмів у пробах досліджуваного ґрунту, провести спостереження за зміною мікробних пейзажів

Матеріали й устаткування: наважка ґрунту 10 г, 2 колби з 100 мл стерильної води, чашки Петрі з стерильними МПА (на двох студентів), 2 стерильні піпетки на 1 мл, скляні та залізні шпателі, пінцети, спиртівки, поживні середовища КАА, Чапека, Ешбі, Виноградського, ґрунтова витяжка по Фішеру, середовище Гетчинсона, добрива, мікроскопи, імерсійна олія, фільтрувальний папір, предметні скельця, бактеріологічна петля, фізіологічний розчин, дистильована вода, барвники за Грамом

Теоретичні положення

Ґрунт є середовищем для існування більшості мікроорганізмів. У ньому живуть бактерії родів Pseudomonas, Bacterium, Arthrobacter, Mycobacterium, Bacillus, Clostridium, різні види грибів, водоростей, найпростіших.

Для визначення чисельності представників еколого-трофічних груп ґрунтової мікрофлори користуються методами:

1) прямого підрахунку клітин під мікроскопом (метод Виноградського). Метод Виноградського дає достовірні, але завищені дані, бо ним неможливо розрізнити живі і мертві клітини мікроорганізмів;

2) культивування мікроорганізмів на поживних середовищах. Для визначення кількості життєздатних клітин у ґрунті користуються методами висіву ґрунтової суспензії на тверді та рідкі поживні середовища. Ці методи дають занижені дані, бо виростають не всі мікроорганізми ґрунту, а лише ті, які здатні до росту на вибраних для досліду середовищах. Методами культивування визначається лише десята частина від кількості мікроорганізмів, що виявляється методом прямого мікроскопування. Запропоновано багато способів посіву і велику кількість поживних середовищ. Найчастіше використовують метод висіву мікроорганізмів з водної суспензії на тверді середовища в чашках Петрі або на рідкі середовища в пробірках;

3) вивчення мікробних пейзажів ґрунту (метод «скелець обростання» М.Г. Холодного, капілярний метод Б.В. Перфільєва і Д.Р. Габе). Ці методи дозволяють дослідити груповий склад мікроорганізмів ґрунту.

Порядок виконання роботи

Робота складається з кількох етапів.

1. Взяття середньої ґрунтової проби і підготовка зразку.

Середню ґрунтову пробу одержують, змішуючи окремі зразки, кількість яких залежить від мікрорельєфу (рівний, хвилястий, схил) та площі. Рекомендують з площі 100 м² брати пробу з трьох точок, з більше ніж 100 м² – з п’яти точок, з 1 га – більше 15 точок. При дослідженні пашні проби беруть з глибини всього орного шару, знімаючи верхній 2-сантиметровий шар, при дослідженні мікрофлори ґрунтового профілю – по генетичним горизонтам (знизу вверх).

Ґрунтовий зразок беруть стерильним буром, стерильною лопатою і стерильним ножем в заздалегідь підготовлену скляну широкогорлу банку, яка закривається корковою пробкою, обгорнутою стерильною ватою, в стерильні поліетиленові або пергаментні мішки. На пакети, банки наклеюють етикетки із зазначенням місця взяття проби, горизонту та інших даних.

Бур, лопату, ніж в полі перед взяттям зразку ретельно очищують, потім обпалюють спиртом.

Ґрунтові зразки аналізують в першу добу. При необхідності допускається зберігання їх в холодильному приміщенні (холодильнику) протягом двох днів. Для більшої однорідності середнього зразку, дотримуючись усіх правил асептики, його ретельно перемішують, виймаючи корені рослин, різні включення.

2. Приготування ґрунтової суспензії та посів.

На стерильному часовому склі стерильним шпателем (або амонієвою ложкою) розмішують 10 г ґрунту. Щоб при зважуванні в ґрунт не потрапили бактерії з повітря, часове скло накривають іншим часовим склом. (Шпателі, ложки, скельця стерилізують фламбуванням). Наважку ґрунту переносять в колбу на 250 мл з 90 мл стерильної водопровідної води, збовтують 10 хвилин на механічній гойдалці і дають відстоятися грубим часткам ґрунту.

Одночасно зі взяттям наважки для аналізу з середньої проби відбирають 10–20 г ґрунту для визначення вологості, оскільки одержані при аналізі дані перераховують на 1 г абсолютно сухого ґрунту.

Встановлено, що більше мікроорганізмів виявляється, якщо наважку заздалегідь помістити в стерильну фарфорову чашку або ступку, зволожити (0,4–0,8 мл води або 0,1 % розчином пірофосфату Na₄P₂O₇ на 1 г ґрунту) і 5 хвилин розтирати стерильним резиновим пестиком або пальцем в стерильній резиновій рукавиці до пастоподібного стану.

Перед приготуванням суспензії для кожного зразку готують дві стерильні колби на 250 мл, одна містить 100 мл стерильної водопровідної води, друга – пуста. Водою з першої колби розтерту ґрунтову масу змивають в пусту стерильну колбу. Колбу з суспензією струшують 5 хвилин, залишають на 30 с і готують розведення, які містять різні концентрації ґрунту. 1 мл суспензії в першій колбі відповідає розведенню 10^-1. Послідуючі розведення (10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6 і т.д.) краще робити в колбах на 250 мл з 90 мл стерильної водопровідної води.

З кожного попереднього розведення окремою стерильною піпеткою беруть 10 мл суспензії і переносять в наступну колбу з 90 мл Н₂О. Кожний раз піпетку споліскують і залишають. Наступні колби струшують по 1 хвилині. З одержаних розведень проводять висіви на щільні та рідкі середовища. Набір середовищ залежить від задач бактеріологічного аналізу ґрунту.

Після певного часу інкубації при 20–30°С культури мікроорганізмів аналізують.

3. Провести спостереження за зміною мікробних пейзажів під впливом добрив.

У три банки вміщують наважки ґрунту по 200 г кожна і проводять дослід за схемою:

1 банка – контроль (ґрунт);

2 банка – органічні добрива (ґрунт + 2 г розмеленого сіна бобових трав);

3 банка – органічні та мінеральні добрива (ґрунт + 2 г розмеленого сіна бобових трав + 100 мг аміачної селітри).

У кожну банку закопують вертикально по 2 скельця на відстані 5 см між ними і витримують банки при температурі 25–28°С, періодично зволожуючи ґрунт. Через два тижні викопують одне скельце, через місяць – друге. Їх поверхню розглядають під мікроскопом, мікробні пейзажі замальовують в зошит.

Лабораторна робота № 14

Тема: Визначення біологічної активності ґрунту

Мета: засвоїти методи визначення біологічної активності ґрунту

Матеріали й устаткування: скельця розміром 10х50 см, стерильні лопатка та ніж, пінцет, лляне полотно розміром 10х50 см, 0,5 % розчин нінгідрину в ацетоні, стерильна колба на 100 мл, резинова пробка зі скляною трубкою, вимірювальна бюретка каталазниці, стаканчик, 3 % розчин перекису водню, повітряно-сухий ґрунт

Теоретичні положення

Для визначення активності ґрунтової мікрофлори користуються наступними методами:

1) дослідження нітрифікаційної здатності, що визначається по наростанню у ґрунті кількості нітратів після його витримування при певних умовах у термостаті. Показник нітрифікації свідчить про потенційну здатність ґрунту накопичувати мінеральний азот;

2) дослідження «дихання ґрунту», або виділення вуглекислого газу дозволяє мати уявлення про енергію процесів розкладу органічної речовини у ґрунті;

3) аплікаційним методом (закладення у ґрунт скелець, що обтягнуті лляною тканиною). Цей метод дозволяє виявити інтенсивність мікробіологічних процесів в різних горизонтах орного шару, встановити вплив різних добрив, пестицидів на ґрунтову мікрофлору;

4) дослідження ферментативної активності ґрунту, оскільки ґрунтові ферменти продукуються в основному мікроорганізмами. Тому між показниками ферментативної активності і певними мікробіологічними процесами спостерігається кореляційна залежність.

Порядок виконання роботи

1. Визначення загальної біологічної активності ґрунту.

Лляним полотном обшити добре вимиті, стерильні скельця розміром 10х50 см. Потім стерильною лопатою та стерильним ножем роблять ґрунтовий розріз на глибину 35 см. До рівної стінки розрізу по профілю прикладають скельце з полотном, відступаючи від поверхні ґрунту 2–3 см. З протилежної сторони його засипають ґрунтом, щільно притискаючи до стінки. На поверхні ґрунту ставлять етикетку. Через 20–30 днів скельця відкопують, підсушують, відділяють від ґрунтових часток і обробляють 0,5 % розчином нінгідрину в ацетоні.

Для визначення ступеню розкладу полотна (в %) вирізають певну його площу на глибині горизонту (аналіз проводять по горизонтам), промивають рештки полотна водою, висушують і зважують. Потім вирізають шматок лляного полотна, який має таку саму площу, з контрольного варіанту і також зважують. Порівнюючи масу першого та другого шматків, визначають ступінь розкладу полотна.

2. Визначення каталазної активності ґрунту.

Каталаза – фермент, за участю якого здійснюється розклад перекису водню. Джерела його формування в дихальному процесі живих організмів різноманітні. Він може утворюватися при окисленні органічних сполук за участю флавінових ферментів. У деяких аеробних мікроорганізмів перекис водню утворюється в результаті переносу однієї пари іонів водню на молекулярний кисень при участі цитохромної системи.

Перенесення електрону по ланцюгу супроводжується синтезом АТФ, тому для мікроорганізмів розклад перекису водню – одне із джерел поповнення запасів високо енергетичних матеріалів для здійснення синтетичних процесів. Каталаза є не лише внутрішньоклітинним ферментом, вона активно виділяється мікроорганізмами в навколишнє середовище, володіє високою стійкістю і може накопичуватись та довгий час зберігатись у ґрунті. Тому каталазну активність ґрунту можна розглядати як показник функціональної активності мікрофлори в різних екологічних умовах.

Для визначення каталазної активності наважку (1 г) повітряно-сухого ґрунту поміщають в колбу на 100 мл, добавляють 20 мг вуглекислого кальцію і ретельно перемішують. Потім обережно на дно колби за допомогою пінцету ставлять маленький стаканчик з 5 мл 3% розчину перекису водню. Колбу щільно закривають резиновою пробкою зі скляною трубкою, яка зв’язана з вимірювальною бюреткою каталазниці.