Файл: Методичка по мікробіології.doc

Вплив антибіотика на мікроорганізми, що тестуються, визначають за величиною відстані між краєм штриха продуцента антибіотика (наприклад, актиноміцету) і початком росту тест-організму. Нечутливі до антибіотичної речовини тест-організми ростуть поблизу штриха продуцента. Якщо антибіотик впливає на тест-організм, то ріст останнього буде спостерігатися удалині від штриха продуцента. Чим більше ця відстань, тим більше чутливий тест-організм до антибіотичної речовини, що утворюється даним продуцентом (рис. 10.1 – 1).

Рис. 10.1. Виявлення антибіотичних властивостей мікроорганізмів за методом перпендикулярних штрихів (1); визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків за методом паперових дисків (2).

2. Визначити чутливість мікроорганізмів до антибіотиків методом паперових дисків.

На чашки Петрі з підсушеним середовищем МПА засівають досліджувану культуру суцільним газоном. Посів роблять шпателем Дригальського чи стерильним ватним тампоном, змоченим суспензією досліджуваної культури. Стерильним пінцетом на агар щільно накладають індикаторні паперові диски (4–5 штук), просочені розчином визначеного антибіотика на рівній відстані один від одного на відстані близько 2,5 см від центру чашки (рис. 10.1 – 2).

Диски нумерують на зворотній стороні дна чашки. Засіяні чашки з нанесеними дисками термостатують (нагору дном) при 37С упродовж 16–18 годин.

Антибіотики, що дифундують у товщу агару, запобігають чи затримують ріст чутливих до них культур мікроорганізмів. Це виявляється в утворенні навколо відповідних дисків зон пригнічення росту, що чітко виділяється на фоні суцільного газону росту культури, яка тестується.

Результати чутливості мікроорганізмів до антибіотиків відобразити у вигляді таблиці. Величина зони пригнічення визначає ступінь чутливості мікроорганізмів до даного антибіотика.

Чутливість мікроорганізмів до антибіотиків

Результати роботи оформити у вигляді звіту.

Лабораторна робота № 11

Тема: Дослідження спиртового та молочнокислого бродіння

Мета: ознайомитися з мікроорганізмами різних систематичних груп, які приймають участь у спиртовому та молочнокислому бродінні

Матеріали й устаткування: мікроскопи, чисті культури дріжджів, пробірка з бражкою, кисле молоко, розсіл огірків чи капусти, кефірні зерна, молочнокислі закваски, бактеріологічні петлі, предметні скельця, фарби, фільтрувальний папір, концентрована Н₂SO₄, 1 %-й розчин біхромату калію, суміш спирту з ефіром (1:1), імерсійна олія

Теоретичні положення

Анаеробний розклад вуглеводів під дією мікроорганізмів на етиловий спирт та вуглекислий газ називається спиртовим бродінням. Головний кінцевий продукт бродіння – етиловий спирт:

С₆Н₁₂О₆ → СН₃СН₂ОН + 2СО₂ + 28,2 ккал

Проміжними продуктами бродіння є фосфорногліцеринова, оцтовий альдегід, піровиноградна кислоти, а побічними – гліцерин, янтарна кислота і сивушні масла (аміловий, ізоаміловий, бутиловий, ізобутиловий та інші спирти).

Збудниками спиртового бродіння є культурні (p. Saccharоmyces) і дикі (p. Torula) дріжджі, деякі плісняві гриби (р. Мисоr) і бактерії (р. Pseudomonas).

На Україні використовуються культурні дріжджі, які відібрані селекційними методами за позитивними для виробництва якостями. Клітини їх овальної форми, розміром 8–10 мкм. Розмножуються переважно брунькуванням, але можуть у несприятливих умовах утворювати спори. Широко поширені в природі дикі дріжджі – в ґрунтах і на поверхні рослин. Характерною ознакою для них є пігментація клітин (рожеві, зелені, чорні), яка захищає їх від сонячної інсоляції. Дріжджі роду Saccharоmyces міцелій не утворюють, а представники роду Torula мають зачатковий міцелій. Більшість дріжджів – сапрофіти, окремі види спричиняють псування харчових продуктів і захворювання людини (кандідози). Дріжджі, які викликають спиртове бродіння, поділяються на дві групи (раси).

Верхові дріжджі ростуть при підвищеній температурі (18–30°С). Бродіння супроводжується пишним і бурхливим виділенням вуглекислого газу та піни, помутнінням субстрату й утворенням пухкого осаду на дні. Ці дріжджі використовуються у хлібопеченні і виготовленні шампанських вин. Характерний представник Saccharomyces cerevisia.

Низові дріжджі можуть жити при низьких температурах (4–15°С). Низове бродіння відбувається спокійно, без бурхливого газоутворення, дріжджі не викликають помутніння субстрату, після закінчення бродіння легко випадають на дно, утворюючи щільний осад. Ці дріжджі використовують у пивоварінні і виноробстві. Представник – Saccharomyces vini.

Спиртове бродіння нормально відбувається в кислому середовищі при рН 4,0–4,5.

Клітини дріжджів мають повний набір дихальних ферментів і добре ростуть в аеробних умовах, утворюючи велику кількість біомаси. Їх використовують для одержання кормового білка (вирощують дріжджі з доступом кисню на мелясі, відходах целюлозної та нафтової промисловості, метанолі, етанолі). Дріжджі використовують також для одержання жирів (типу рослинної олії). Вони постачають нас вітамінами групи В. Методами генної інженерії дріжджам надають нові якості – вони починають продукувати біологічно активні речовини (інтерферон та інші), які використовуються як цінні медичні препарати.

Під час молочнокислого бродіння відбувається розклад вуглеводів в анаеробних умовах з утворенням молочної кислоти. Серед побічних продуктів утворюються оцтова кислота, вуглекислий газ, інколи етиловий спирт.

Молочнокислі бактерії, які здійснюють цей процес, за формою – палички і коки. Це грампозитивні мікроорганізми, спор не утворюють, переважно нерухомі, факультативні анаероби. Особливістю даної групи бактерій є слабкість їх біосинтетичних можливостей. Вони не здатні до синтезу, тому залежать від присутності у середовищі багатьох речовин: усіх амінокислот, вітамінів групи В, компонентів нуклеїнових кислот. Молочнокислі бактерії широко розповсюджені в природі, зустрічаються на поверхні рослин, у ґрунті, в кишковому тракті людини й тварин і, насамперед, у молоці та молочнокислих продуктах. За характером бродіння, яке вони викликають, виділяють такі групи:

Гомоферментативні, або типові бактерії – утворюють переважно одну молочну кислоту, яка становить 90 % усіх продуктів бродіння:

С₆Н₁₂О₆ → 2СН₃СНОНСООН + СО₂ + 94,3 кДж

Збудниками гомоферментативного бродіння є: Streptococcus lactis – молочнокислий стрептокок, клітини в якому розташовані у вигляді диплококів та коротеньких ланцюжків, викликає закисання молока; Lactobacterium bulgaricum – болгарська паличка використовується для виготовлення кислого молока; Lactobacterium cucumeris – огіркова паличка, утворює ланцюжки, бере участь у квашенні огірків; Lactobacterium plantarum – бере участь у квашенні овочів і силосуванні кормів; Lactobacterium casei – відіграє роль при дозріванні сирів; Lactobacterium acidophilus – використовується для виготовлення ацидофіліна.

Гетероферментативні, або нетипові бактерії – утворюють з вуглеводів, крім молочної, значну кількість оцтової кислоти, вуглекислий газ, етиловий спирт і гліцерин:

С₆Н₁₂О₆ → СН₃СНОНСООН + СН₃СООН + СН₂ОНСНОНСН₂ОН + СН₃СН₂ОН + СО₂

До збудників гетероферментативного молочнокислого бродіння належать Lactobacterium brassica – капустяна паличка, Betabacterium brevis. Вони зустрічаються на рослинах та у хлібних заквасках.

Біфідобактерії мають вигляд прямих або розгалужених паличок, У-форми, булавовидні та лопатовидні, нерухомі, безспорові, грампозитивні. Типовий представник – Bacterium bifidum. Біфідобактерії живуть у кишковому тракті людини, тварин та комах. Вони синтезують антибіотики, з чистих культур готують лікувальний молочнокислий біфідін.

Молочнокислі бактерії використовують для виготовлення кисломолочних продуктів, сирів, для квашення овочів і силосування; у промисловості – для одержання молочної кислоти.

Кисломолочні продукти бувають двох типів:

1) простого бродіння – кисле молоко, сметана, ацидофілія, ряжанка;

2) змішаного бродіння – кефір та кумис.

Кефір виготовляють за допомогою кефірних зерен, які є симбіотичним комплексом молочнокислих бактерій та дріжджів, а кумис – за допомогою заквасок, які також складаються з молочнокислих бактерій та дріжджів.

Порядок виконання роботи:

1. Вивчити збудників спиртового бродіння.

Приготувати мазок з культури дріжджів, висушити, зафіксувати його, пофарбувати фуксином 2 хвилини, промити водою, висушити, подивитись під мікроскопом на об'єктиві 90х з імерсією, замалювати в зошит.

2. Провести якісну реакцію на етиловий спирт.

До 3–4 мл бражки додають 2–3 краплі концентрованої сірчаної кислоти й крапають 1 %-й розчин біхромата калію до переходу оранжевого кольору в синьо-зелений за рахунок взаємодії біхромата калію і сірчаної кислоти з етиловим спиртом.

3. Вивчити збудників молочнокислого бродіння.

Молочнокисле бродіння викликають молочнокислі бактерії, котрі за морфологічними ознаками розподіляються на молочнокислі палички та молочнокислі стрептококи. Для виділення останніх застосовують метод збагачення.

Свіже молоко наливають в 1–2 стерильні пробірки по 5–6 мл і залишають при t = 30°С для розвитку бактерій. Чергові три пробірки з молоком заражають сметаною, сиром, кефіром і культивують 24 год при t = 30°С. Потім готують мазки із сироватки молока, що зсілося, з усіх пробірок. Препарати сушать, фіксують у полум’ї пальника. Жир знімають, накладаючи фільтрувальний папір на гарячий мазок. Мазок підфарбовують метиленовою синькою (фарбник добре забарвлює мікроби і погано – казеїн молока), мікроскопують і замальовують.

Для виділення чистої культури бактеріальною петлею молоко, що зсілося, з одібраних пробірок переносять у пробірку з 10 мл стерильного фізіологічного розчину, ретельно розмішують, потім висівають із пробірок по одній петлі в МПА з 2 % цукру, останній виливають у чашки Петрі. Через дві доби при t = 30°С на агарі виростають дрібні колонії: на поверхні – округлі, краплини близько 1 мм у діаметрі та глибинні – у вигляді черевичок. Форму колоній розглядають у бінокулярний мікроскоп і замальовують.

Із 4–5 ізольованих колоній роблять посів у пробірки із стерильним молоком. Посіви вирощують при t = 30°С. З пробірок, які містять молоко, готують і продивляються препарати. Чисті культури повинні містити однорідні диплококи, короткі ланцюжки або палички.

4. Провести якісні реакції на виявлення молочної кислоти.

Молочна кислота в кислому середовищі при температурі кипіння окислюється КМgО₄ в оцтовий альдегід, який з аміачним розчином срібла дає характерну реакцію «срібного дзеркала».

Молочнокислий затір звільняють від осаду за допомогою паперового фільтра або центрифуги. Супернатант у об’ємі 5–7 мл вміщують в 50 мл колбу, додають 1 мл 10 % розчину сірчаної кислоти і нагрівають до кипіння. Додають краплями 2 %-ний розчин КМgО₄ Молочна кислота перетворюється на оцтовий альдегід. Останній виявляють за допомогою фільтрувального паперу, змоченого аміачним розчином азотного срібла. Таким папером накривають колбу з супернатантом. Внаслідок дії оцтового альдегіду на аміачний розчин срібла папір чорніє.

Для приготування аміачного розчину AgNО₃ у пробірку вміщують 1–2 мл 10 %-ного розчину азотнокислого срібла і додають по краплі аміак. Спочатку з’являється бура муть (Ag₂О), котра потім розчиняється в NН₃ Цим розчином і змочують папір.

Результати роботи оформити у вигляді звіту.

Лабораторна робота № 12

Тема: Біологічна фіксація азоту. Дослідження вільноживучих та симбіотичних азотфіксаторів

Мета: ознайомитися з вільноживучими та симбіотичними азотфіксаторами

Матеріали й устаткування: мікроскопи, бактеріологічні петлі, набір фарб, предметні скельця, стерильна вода, імерсійна олія, спиртівки, чашки Петрі із стерильним безазотистим середовищем Ешбі (1 на двох студентів), шпателі для розкладання ґрунту, ґрунт у чашках Петрі, пінцети, скальпелі, 96 %- ний етиловий спирт, свіжий корінь бобової рослини з бульбочками, ботанічна бритва, препарувальні голки

Теоретичні положення

Кожного року з урожаєм сільськогосподарських культур з ґрунту виноситься 100–120 млн. тонн азоту. З мінеральними азотними добривами повертається в ґрунт лише 15–25 % від зазначеної кількості. При такому співвідношенні запас азоту в ґрунтах міг би вичерпатися за 50–75 років, однак цього не відбувається внаслідок біологічної фіксації азоту атмосфери.

Процес біологічної фіксації молекулярного азоту й утворенням з нього органічних азотистих сполук мікробних клітин називається азотфіксацією. Останню здійснюють азотфіксуючі мікроорганізми. Азотфіксатори бувають вільноживучі (живуть у ґрунті самостійно) і симбіотичні (живуть у симбіозі з вищими рослинами).

Головними представниками вільноживучих азотфіксаторів є аеробні бактерії родів Azotobacter, Beijerinckia, анаеробні бактерії роду Clostridium, а також багато видів ціанобактерій (синьо-зелені водорості). Типовий представник анаеробних азотфіксаторів – Clostridium pasteurianum – належить до маслянокислих бактерій.

В молодій культурі Clostridium pasteurianum клітини мають форму паличок з перитрихіальним розташуванням джгутиків, потім клітина утворює спору, яка може розташовуватися ближче до краю, а частіше всередині клітини. Спори овальні, покриті оболонкою. Клітини мають клостридіальну форму, накопичують гранульозу, яка зафарблюється при дії розчину Люголя в синьо-фіолетовий колір. В період утворення спор гранульоза зникає. Зустрічаються в ґрунтах, забруднених водоймах тощо.

Усі представники роду Azotobacter – аеробні, грамнегативні, великі клітини, можуть окислювати органічні сполуки, живуть лише при нейтральній реакції середовища (рН не нижче 6,0). Найпоширеніший вид – Azotobacter chroococcum. У молодому віці – це паличкоподібні, рухомі клітини, з віком заокруглюються й розташовуються попарно («вісімки»). Клітини назовні оточені товстою слизовою капсулою. Бактерії цього виду утворюють темний пігмент меланін, який надає колоніям характерне буре забарвлення. За рік азотобактер фіксує 20–30 кг/га азоту. Бактерії роду Beijerinсkia sp. відрізняються від роду Azotobacter sp. більшою стійкістю до кислотності ґрунтів і можуть розмножуватися при рН 3,0