Файл: Методичн_ рекомендац_ї 2 частина.doc

4.2. Теоретичні питання до заняття:

• Діагностикуми, їх характеристика, принципи отримання і практичне використання.

• Трьохкомпонентні та багатокомпонентні серологічні реакції (імунного лізису, реакція зв’язування комплементу, опсонофагоцитарна, непрямої аглютинації), їх суть, практичне використання.

• Система комплементу, шляхи її активації, біологічне значення.

• Реакція імунного гемолізу, механізм, практичне використання.

• Оцінка результатів серологічних реакцій і висновки.

• Реакції бактеріолізу, цитолізу, їх механізм та практичне використання.

4.3. Практичні завдання, які виконуються на занятті:

• Провести облік розгорнутої реакції аглютинації, поставленої з метою серологічної ідентифікації культури бактерій.

• Поставити реакцію Відаля для серологічної діагностики черевного тифу.

• Здійснити облік результатів РНГА, поставленої з метою серодіагностики черевного тифу, зробити висновок

• Провести облік результатів реакції імунного гемолізу, зробити висновок.

• Вивчити зразки діагностикумів.

5. Зміст теми:

На практичному занятті студенти знайомляться зі складними серологічними реакціями, розглядають особливості постановки та компоненти реакції аглютинації і методику постановки реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) з метою серологічної діагностики інфекційних захворювань. Студенти проводять облік реакції аглютинації, поставленої з метою ідентифікації культури бактерій; ставлять реакцію Відаля для діагностики черевного тифу; здійснюють облік РНГА, поставленої з метою серодіагностики черевного тифу; ставлять реакцію імунного гемолізу; вивчають зразки діагностикумів. Виконані завдання студенти записують у протокол та підписують його у викладача.

Рекомендації для оформлення протоколу.

5.1. Облік поставленої на попередньому занятті реакції аглютинації з метою серологічної ідентифікації культури бактерій.

Студенти проводять остаточний облік поставленої на попередньому занятті реакції аглютинації з метою ідентифікації культури бактерій. Ступінь позитивної реакції аглютинації позначається плюсами:

++++ - повна аглютинація, рідина прозора, а на дні значна кількість білого осаду;

+++ - рідина не зовсім прозора, осад менший;

++ - рідина непрозора, осад ще менший;

+ - рідина мутна, дуже незначний осад;

- - рідина рівномірно мутна, як в контролі антигену; осад відсутній. Результат в цьому випадку вважають негативним.

Відповідність між видом мікроба і діагностичною аглютинуючою сироваткою вважається достовірною при умові чітко вираженої реакції аглютинації в пробірках з розведенням сироватки в межах титру, але не менше 2/3 її титру при відсутності осаду в контролях сироватки і культури.

5.2. Постановка реакції аглютинації з метою виявлення антитіл в сироватці хворого з підозрою на черевний тиф та паратифи а та в.

Для проведення реакції беруть у хворого кров, одержують з неї сироватку і розводять ізотонічним розчином натрію хлориду від 1:50 до 1:800 за схемою. Як антиген в цій реакції використовують діагностикуми – суспензії із відомих убитих мікроорганізмів – черевного тифу та паратифів А та В.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦІЇ АГЛЮТИНАЦІЇ З МЕТОЮ ВИЯВЛЕННЯ АНТИТІЛ В СИРОВАТЦІ КРОВІ ХВОРОГО

Штатив з пробірками поміщають в термостат при 37⁰С. Попередній облік реакції проводять через 2 години, а остаточний – через 18-20 годин.

5.3. Принцип постановки та облік результатів реакції непрямої гемаглютинації (рнга), поставленої з метою серологічної діагностики.

Суть реакції непрямої гемаглютинації полягає в тому, що еритроцити, на поверхні яких адсорбовані будь-які розчинні антигени, набувають здатності аглютинуватись при взаємодії з антитілами, специфічними до адсорбованого антигену. Еритроцити, що сенсибілізовані антигенами, називаються еритроцитарними діагностикумами. Найчастіше використовують еритроцити барана, яким властива висока адсорбуюча активність. Реакцію ставлять за такою схемою: в пробірках або лунках прогріту впродовж 30 хв. при 58⁰ С досліджувану сироватку розводять послідовно від 1:10 до 1:320 в об’ємі 0,25 мл та додають по 2 краплі еритроцитарного діагностикуму. Реакцію супроводжують контролями: на спонтанну аглютинацію сенсибілізованих еритроцитів, контроль з нормальними еритроцитами, а також контролі діагностикумів з завідомо позитивною та негативною сироватками. Після легкого струшування пробірки або лунки витримують в термостаті 30-45 хв. при 37⁰ С. Облік результатів реакції здійснюють після того, коли випадуть в осад еритроцити у відповідних контрольних пробірках. Достовірними результатами слід вважати відсутність гемаглютинації в контролях з нормальними, сенсибілізованими еритроцитами, з завідомо негативною сироваткою і наявність гемаглютинації і з завідомо позитивною сироваткою. Гемаглютинація в дослідних пробірках при відповідних контролях свідчить про наявність специфічних антитіл в досліджуваній сироватці. Результати оцінюють за зовнішнім виглядом осаду еритроцитів в лунках. В позитивному випадку (+) еритроцити рівномірно у вигляді “парасольки” покривають майже все дно пробірки або лунки. При негативному результаті (-) еритроцити осідають у формі компактного комочка – “гудзика”.

5.4. Постановка реакції імунного гемолізу.

Імунний лізис – це розчинення клітин (антигенів) під дією специфічних антитіл (лізінів) в присутності комплементу. В залежності від антигенів, що беруть участь в реакції лізису, вона одержала назву бактеріолізу, спірохетолізу, гемолізу тощо. Найчастіше використовується в лабораторній практиці реакція гемолізу як індикаторна система в реакції зв’язування комплементу. Для постановки реакції потрібні: 1) антиген – 3% суспензія еритроцитів; 2) антитіло – гемолітична сироватка проти еритроцитів барана; 3) комплемент – сироватка морської свинки, розведена 1:10; 4) ізотонічний розчин хлориду натрію.